研究RNA，這些技術必須知道

RNA最近幾年可火了，除了有編碼蛋白作用的mRNA外，還有很多非編碼RNA，例如miRNA、lncRNA、circRNA、piRNA（最近的幾篇paper證明ncRNA也可以編碼蛋白，請點擊）等，它們直接或者間接調節mRNA的翻譯、基因轉錄的調控，這些非編碼RNA之間也能crosstalk了，產生了交談所使用的語言MRE(miRNA response element)，ncRNA便可以靈活地通過調控miRNA調控mRNA的翻譯了，但是RNA都有哪些常規的檢測分析技術呢

一般來講我們需要知道RNA的以下信息：

RNA的完整性

RNA的長度、序列

RNA在細胞、組織的差異變化

RNA在細胞中的分布

RNA在基因組上的定位

RNA的時空變化

（一）RNA的完整性

技術：瓊脂糖凝膠電泳

分離完整的RNA在基因表達分析所用的眾多技術中是必不可少的，但是RNA抽提過程中，機械力的作用下，較長的RNA容易斷裂、降解，完整性差的RNA抽提物不利於下游的分析實驗。

完整的總RNA在進行變性凝膠電泳時會產生清晰的28S和18S rRNA條帶（真核樣品）。28S rRNA條帶的強度應當大致為18S rRNA條帶的兩倍（圖1，第3條泳道）。這種2:1的比率（28S：18S）是判斷RNA完整性的一個很好的指標。

（二）RNA的長度、序列

技術1：普通PCR、一代測序

如果知道目標RNA的5』端序列，設計引物對mRNA、ncRNA進行反轉錄，PCR擴增後，去測序，便可以知道準確的序列和長度，這種最簡單了，這種測序一次性最多保證測700bp。

技術2：RACE

經典的RACE技術是通過RT-PCR技術，由已知部分cDNA序列來得到完整的cDNA5"和3"端，包括單邊PCR和錨定PCR。

（三）RNA在細胞、組織中的差異變化

技術：DNA晶元、二代高通量測序、Q-PCR

病灶組織和病灶周圍組織的小RNA、ncRNA的丰度變化，有助於疾病的研究，可以通過核酸晶元或者二代高通量測序RNA-seq。

自二十世紀九十年代中期以來，晶元就一直是基因組表達分析的中堅力量。在這一技術最輝煌的時期，準備研究基因表達模式的人都會想到使用晶元。不過隨著測序成本的直線下降，RNA測序（RNA-seq）成為了越來越受歡迎的轉錄 組分析方法。

DNA晶元上排列著大量的核酸探針，可以代表生物的整個基因組或轉錄組，比如miRNA、circRNA等等。用晶元分析基因表達需要抽提RNA，將其反轉錄為cDNA，然後進行熒游標記。晶元上各點的信號強弱，代表了該探針目的基因的表達量。

高通量測序技術是對傳統測序一次革命性的改變，一次對幾十萬到幾百萬條cDNA分子進行序列測定，又被稱為深度測序(deep sequencing)。

所以你對病灶組織和病灶周圍組織的ncRNA做二代測序，再生信分析後，會看到病灶組織中有一部分RNA丰度上調，有一部分RNA丰度下調，再結合有關資料庫，集中在幾個RNA進行後續研究，有必要的話用Q-PCR再次確認丰度變化的結果。

（四）RNA在細胞中的分布

技術：RNA原位雜交(RNA in situ hybridization)

因為RNA可以在轉錄水平、轉錄後水平參與調控作用，其既可以在胞核也可以在胞漿甚至胞外發揮功能。那麼RNA的分布也是研究者所關心的問題，這個問題可以用RNA原位雜交順便來研究。另外，如果RNA能與蛋白結合并改變蛋白定位，那麼就可以藉助ISH來研究蛋白定位。

原位雜交是指將特定標記的已知順序核酸為探針與細胞或組織切片中核酸進行雜交，從而對特定核酸順序進行精確定量定位的過程。原位雜交可以在細胞標本或組織標本上進行。根據RNA序列設計cDNA、cRNA探針，對目標進行定位。

（五）RNA在基因組上的定位

技術：原位雜交(Fluoresence in situ hybridization)

原理同上，只不過這次探針結合的不是RNA，變成細胞核中的染色體上的染色質上的DNA序列，這可以反映RNA的原始基因組位點。

（六）RNA的時空變化

技術：EU RNA標記技術

EU是一種尿嘧啶核苷類似物，含有在天然化合物中很少見的炔羥基團，EU分子很小，容易在細胞內自由擴散，不需要嚴格的樣品處理，能夠插入正在轉錄的RNA分子中，基於EU與染料的共軛反應可以進行高效快速的細胞增殖檢測分析，能夠在組織、器官的整體水平上準確觀察RNA轉錄的真實情況，能夠更方便地研究RNA轉錄位點，結合相關抗體標記能夠檢測與RNA有相互作用的蛋白。

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