直接將艾滋病毒「剔除」掉？基因編輯再顯神威

作者：中國科普博覽 文字取材於科普中國作品《「基因敲除狗」是怎麼造出來的？》

美國天普大學華人科學家胡文輝等人近日報告說，他們利用基因編輯技術，有效剔除了一種人源化小鼠多個器官組織中的人類艾滋病病毒，朝著開展人類臨床試驗的方向邁出一大步。

這次所用的基因編輯技術是CRISPR/Cas9技術，顧名思義，這項技術能夠讓人類對目標基因進行「編輯」，實現對特定DNA片段的敲除、加入等。自CRISPR/Cas9技術問世以來，就有著其它基因編輯技術無可比擬的優勢，技術不斷改進後，更被認為能夠在活細胞中最有效、最便捷地「編輯」任何基因。

CRISPR/Cas9是繼「鋅指核酸內切酶（ZFN）」、「類轉錄激活因子效應物核酸酶（TALEN）」之後出現的第三代「基因組定點編輯技術」。與前兩代技術相比，其成本低、製作簡便、快捷高效的優點，讓它迅速風靡於世界各地的實驗室，成為科研、醫療等領域的有效工具。

CRISPR/Cas9技術的靈感來源於細菌的一種獲得性免疫系統。與哺乳動物的二次免疫應答類似，細菌在抵抗病毒或外源質粒入侵時，會產生相應的「記憶」，來抵抗該種外源遺傳物質的再次入侵，而這種獲得性免疫正是由細菌的CRISPR/Cas系統實現的。

那麼CRISPR/Cas9技術的實現需要什麼那些條件呢？

首先，在CRISPR/Cas9技術中，我們把即將被編輯的細胞基因組DNA看作病毒或外源DNA。基因編輯的實現只需要兩個工具——嚮導RNA（guide RNA, gRNA）和Cas9蛋白。

其中，嚮導RNA的設計並不是隨機的，待編輯的區域附近需要存在相對保守的PAM序列（即三鹼基序列NGG，其中N可以是任意鹼基），而且嚮導RNA要與PAM上游的序列鹼基互補配對。以基因敲除為例，如圖3所示，在待敲除基因的上下游各設計一條嚮導RNA(嚮導RNA1，嚮導RNA2)，將其與含有Cas9蛋白編碼基因的質粒一同轉入細胞中，嚮導RNA通過鹼基互補配對可以靶向PAM附近的目標序列，Cas9蛋白會使該基因上下游的DNA雙鏈斷裂。

對於DNA雙鏈的斷裂這一生物事件，生物體自身存在著DNA損傷修復的應答機制，會將斷裂上下游兩端的序列連接起來，從而實現了細胞中目標基因的敲除。

圖1 CRISPR/Cas9技術敲除掉部分基因原理圖（繪圖 肖媛）

而DNA片斷的插入或定點突變的實現，只需在此基礎上為細胞提供一個修復的模板質粒，這樣細胞就會按照提供的模板在修復過程中引入片段插入或定點突變，對受精卵細胞進行基因編輯，並將其導入代孕母體中，可以實現基因編輯動物模型的構建。

圖2 CRISPR/Cas9技術插入新基因原理圖（繪圖 肖媛）

當然，CRISPR/Cas9技術的成功率並非百分之百。嚮導RNA靶向序列的非特異性，以及DNA損傷修復的不確定性，都可能會導致基因組上其它位置產生未知的突變，也就是所謂的「脫靶」現象，這也是現階段影響CRISPR/Cas9技術應用的瓶頸之一。但隨著科研人員不斷對Cas9蛋白的優化改造，對靶基因識別特異性的增強， CRISPR/Cas9技術的「打靶」效率將不斷提高。

CRISPR/Cas9技術在醫療健康、生產生活、家畜育種等領域的應用，不斷取得喜人的新成果。

如在醫療健康領域，用iPS細胞（誘導多能幹細胞）治療人類的鐮刀形貧血症，可以將病人的皮膚細胞誘導成iPS細胞，利用CRISPR/Cas9技術介導同源重組來修複發生突變的血紅蛋白基因，再將修復的iPS細胞定向誘導分化為造血幹細胞移植到病人體內。此外，像使用CRISPR技術根除HIV病毒、誘導宮頸癌細胞自我毀滅、構建癌症模型等最新成果先後被Nature等著名雜誌所報道。在奶製品的發酵中，利用CRISPR/Cas9增強發酵菌株對噬菌體的防禦能力；在家畜育種方面，也正在利用基因編輯工具通過對顯著影響家畜生產性能的基因位點進行改良，以實現豬、牛、羊等大型家畜生產性能的提高等。

作為生命科學領域的一項重大突破，CRISPR/Cas9的創新性、技術性毋庸置疑，隨著對CRISPR系統認識的加深，實驗設計的優化改造，相信其打靶效率會進一步提高，CRISPR/Cas9以及其衍生技術終究會帶來一場科學史上的巨大變革。

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