刷屏的張鋒團隊CRISPR重磅新應用緣何如此厲害？背後竟有諾獎級技術的支持！

今天，華人科學家張鋒大神又刷屏了。他和James Collins教授團隊，聯合將CRISPR-Cas13a改造成了靈敏度達到了阿摩爾級（aM，10的負18次方摩爾每升），可以檢測單分子的SHERLOCK技術。這一重要成果刊登在今天的《科學》雜誌上[1]。

James Collins教授（左）張鋒教授（右）

就在大家在為張鋒大神歡呼雀躍，在為CRISPR-Cas13a叫好的時候。我們發現，讓SHERLOCK技術達到阿摩爾級靈敏度的不是CRISPR-Cas13a，是它的搭檔，另一個顛覆性的發明重組聚合酶擴增技術（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）。很少有報道提起她，她就那樣默默站在CRISPR-Cas13a背後。

RPA有多厲害？據說可以媲美PCR技術。什麼是PCR？著名發明家Kary Mullis因為發明這個技術於1993年獲得諾貝爾獎……據了解RPA技術是由英國科技公司TwistDx發明的，發明人是Niall A. Armes和Derek L. Stemple。如果張鋒和Collins教授的這項發明最終能造福人類，我們也應該記住RPA的發明人。

接下來我們就看看RPA和CRISPR-Cas13a聯手，如何鑄就SHERLOCK技術的。

SHERLOCK與我們特別熟悉的CRISPR-Cas9有本質上的區別，它使用的酶是Cas13a。Cas9靶向切割的是DNA，而Cas13a靶向的則是RNA；而且Cas13a是一個「奇怪而又瘋狂」的酶，像Cas9在切割完特定片段後就會失活，但Cas13a則會像「吃了炫邁一樣停不下來」，在切割了自己應該切割的RNA後，它還會繼續去切割其他遇到的RNA。

其實在去年的6月份，張鋒教授就在《科學》雜誌上介紹過這個可以在細菌細胞中切割特定RNA序列的「奇怪而又瘋狂」的酶了[2]。然而在面世僅僅三個月後，另一位在CRISPR基因編輯系統領域做出卓越貢獻的「大神」就「找了個茬」，我想，大家應該已經猜到了，這位大神就是與張鋒教授有著專利之爭的，加州大學伯克利分校的Jennifer Doudna教授。

Jennifer Doudna教授

Doudna教授和她的同事在《自然》雜誌上發表研究，他們對Cas13a的潛力進行了驗證。結果顯示，如果想要讓Cas13a順利地與特定RNA結合，樣本中至少需要數百萬RNA分子，因此，使用Cas13a其實是達不到許多基礎研究和臨床應用所需要的靈敏度的[3]。

這樣的CRISPR-Cas13a是不能被稱為「SHERLOCK」的，那麼張鋒教授是如何讓它「開掛般」提高靈敏度的呢？這還要感謝和張峰教授同在Broad研究所工作的，合成生物學領域的「大牛」——James Collins教授，他同時也是這次報告的聯合通訊作者。兩位「大牛」攜手，他們想到了一個「外援」—— RPA。

初始的Cas13a和「進化」後的SHERLOCK靈敏度的對比

常規的PCR也可以擴增特定DNA片段，提高靈敏度，但是PCR對溫度的控制有很複雜的要求，要經歷高溫變性、低溫復性還有中溫延伸三個步驟。RPA就不需要這麼麻煩，它的反應需要三種在常溫下有活性的酶，最適溫度在37-42℃之間，不需要變性過程，這樣就大大加快了擴增的速度。再加上不需要溫控設備，兩者共同打造了真正攜帶型的快速DNA擴增技術。

不僅方便快捷，RPA更「迷人」的地方在於擴增量十分高，能夠將痕量的核酸（尤其是DNA）模板擴增到能夠可以檢測到的水平。痕量，顧名思義就是「該物質雖然存在，但只有『痕迹』，無法用一般方法定量檢測，通常含量＜0.1mg」，所以大家就知道RPA有多厲害了吧？利用它可以從單分子得到大約1012的擴增產物。而且RPA還不需要複雜的樣品處理，及時環境限制，無法提取核酸，也難不倒它[4]。

利用RPA，在室溫中，樣品中DNA或RNA的含量就可以得到提升，一旦含量增加了，再將DNA轉化為RNA。如此，Cas13a就有資格進化成「SHERLOCK」了！

不過SHERLOCK其實是一個「團隊」，研究人員給Cas13a「配備」了兩個助手：一個是引導它到達應該被切割的特異性RNA的「嚮導RNA」；另一個叫做「報告RNA」，因為Cas13a在切割完特定RNA後不會失活，所以在Cas13a完成任務開始「作亂」的時候，報告RNA就會被切斷，發出熒光信號。研究人員們就知道，它已經找到了與其相匹配的RNA序列。

SHERLOCK的工作原理

那麼SHERLOCK現在能為我們做什麼呢？研究人員已經證實，它可以應用於多種疾病，例如傳染病病原體的檢測、癌症相關的基因突變的檢測。

在研究中，他們用含有寨卡病毒和登革熱病毒的血樣進行了測試，結果顯示，即使病毒的滴度（即病毒的毒力）很低，SHERLOCK還是能捕捉到，而且對於類型很是相似的非洲寨卡病毒和美洲寨卡病毒，SHERLOCK也能準確的分辨出它們的「身份」。除了血液之外，唾液和尿液也都可以「為SHERLOCK所用」。

使用SHERLOCK可以分辨出美洲寨卡病毒和非洲寨卡病毒，兩種病毒株差異顯著

除了病毒的檢測外，在大熱的癌症液體活檢方面，SHERLOCK也顯示了一把它的身手。在人體內，每時每刻都有DNA片段進入血液循環中，對於腫瘤患者來說也不例外，所以血液中也能檢測到與腫瘤有關的DNA片段。但是腫瘤相關DNA的比例極低，因而檢測的難度也是很大的。在研究人員的設計下，他們用酶將DNA轉化為RNA，這樣SHERLOCK就可以靶定血液中的與腫瘤有關的突變了！

研究人員以兩個基因突變為例，進行了驗證，他們發現，即使突變的基因只佔到基因組DNA的0.1%，SHERLOCK還是能夠將它們檢測出來！這無疑會為液體活檢領域帶來不小的進步。研究的第一作者Jonathan Gootenberg說：「SHERLOCK對兩種類型的核酸（DNA和RNA）都很有用，它真正的優勢在於切割完特定片段之後還具有活性，能夠觸發『熒光報告』，讓我們知道。」

除了這些之外，SHERLOCK還可以檢測人類基因組中的多個單核苷酸多態性（SNP，指基因組水平上單個核苷酸變異引起的DNA序列的多態性，是人類可遺傳變異中最常見的一種）、抗生素抗性基因、區別包括大腸桿菌和銅綠假單胞菌在內的5種特定類型的細菌，而且根據研究人員的介紹，SHERLOCK甚至還可以區分肺炎球菌和桿菌不同的耐葯突變類型！這些對於細菌感染患者的診斷、治療都有非常重大的意義。

在人類基因組中，SHERLOCK可以檢測出不同的多個單核苷酸多態性（SNP）

對於如此強大的SHERLOCK，曾經「挑過刺兒」的Doudna教授表示，「未來有很多疾病的檢測會應用到SHERLOCK，我們很高興看到他們的新成果建立在我們曾經提出的『疾病檢測』的主意上，而且我們曾經的『檢驗工作』看起來對他們也非常有幫助。」[5]

目前，SHERLOCK在使用的時候可以將所需要的化學物質放在一張玻璃纖維紙上，在各種場景中使用，而且每次的成本只需要61美分。研究人員認為，如此方便、快捷的測試對於新傳染病爆發時的準確檢測有著十分重大的意義，因為傳染病最開始出現的地方往往是一些環境較差的不發達國家。

由於SHERLOCK廣泛的應用範圍，所以如何「商業化」也是研究人員很關心的一個問題，Collins教授說，他們目前正在積極的探索中，很可能會成立一家公司來實現這個目標。當然了，商業化的SHERLOCK什麼時候能夠正式進入市場，這一切都還需要技術的繼續完善和FDA等機構的監督和認可。

參考文獻：

[1]Jonathan S. Gootenberg et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science, 2017 DOI:10.1126/science.aam9321

[2]Abudayyeh O O, Gootenberg J S, Konermann S, et al. C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector[J]. Science, 2016, 353(6299): aaf5573.

[3] East-Seletsky A, O』Connell M R, Knight S C, et al. Two distinct RNase activities of CRISPR-C2c2 enable guide-RNA processing and RNA detection[J]. Nature, 2016, 538(7624): 270-273.

[4]Piepenburg O, Williams C H, Armes N A, et al. Recombinase polymerase amplification: U.S. Patent 7,399,590[P]. 2008-7-15.

[5]http://www.sciencemag.org/news/2017/04/new-crispr-tool-can-detect-tiny-amounts-viruses

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