微生物鑒定之生化實驗大全

科技 04-16

微生物鑒定之生化實驗大全

不同的細菌具有各自的獨特的酶系統，因而對底物的分解能力各異，其代謝的產物也不相同。這些代謝產物又具有不同的生物化學特性，可利用生物化學的方法測定這些代謝產物以鑒定細菌。掌握各種生化反應的原理和應用是細菌鑒定的基礎。生理生化特性的測定主要根據Shirling & Gottlieb《InternationalJournal of Systematic Bacteriology》中鑒定的有關試驗。

（一）碳水化合物代謝實驗

糖（醇、苷）類發酵實驗

（1）原理：

細菌分解糖的能力與該菌是否含有分解某種糖的酶密切相關，故分解糖的能力各不相同，細菌分解糖類後的終產物亦不一致，在含糖培養基中加入指示劑，若細菌分解糖則產酸或產酸產氣，使培養基顏色改變，從而判斷細菌是否分解某種糖或其他碳水化合物

（2）基本培養基：

在培養基中加入0.5%～1%的糖類（單糖、雙糖、或者多糖）、醇類（甘露醇、肌醇）苷類（水楊苷、菊糖等）。培養基可為液體、半固體、固體或微量生化管幾種類型。

（3）實驗方法：

取某一種細菌的24h純培養物分別接種到葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖等培養基內，37℃培養24h，觀察結果並記錄。

（4）結果判定：

如果接種進去的細菌可發酵某種糖或醇，則可產酸，使培養基由紫色變成黃色，如果不發酵，則仍保持紫色。如，發酵的同時又產生氣體，則在微量發酵管頂部積有氣泡。

（5）應用：

是鑒定細菌最主要最基本的實驗，特別是對腸桿菌科細菌的鑒定尤為重要。

氧化型與發酵型(O/F)的測定

（1）原理：

細菌在分解葡萄糖的過程中，必需有氧的參加的，稱為氧化型，細菌在分解葡萄糖的過程中，可以進行無氧降解的，稱為發酵型。發酵型細菌無論在有氧或者無氧的環境中都能分解葡萄糖。不分解葡萄糖的細菌稱為產鹼型。這在區別微球菌與葡萄球菌、腸桿菌科成員中尤其有意義。

（2）培養基：

培養基蛋白腖2g，氯化鈉5g，磷酸氫二鉀0.3g，葡萄糖10g，瓊脂3g，1％溴麝香草酚藍3mL，蒸餾水1000mL。將蛋白腖、鹽、瓊脂和水混合，加熱溶解，校正pH至7.2，然後加葡萄糖和指示劑，加熱溶解；分裝試管，3～4mL/管；115℃，高壓蒸汽滅菌20min，取出後冷卻成瓊脂柱。

（3）實驗方法：

挑取18～24h的幼齡斜面培養物，穿刺接種，每種細菌接種兩管，於其中1管覆蓋1mL滅菌的液體石蠟，37℃培養24小時或更長時間。

（4）結果判定。

Β-半乳糖苷(ONPG)實驗

（1）原理：

有的細菌可以產生β一半乳糖苷酶，能分解鄰－硝基酚－β－D－半乳糖苷，而生成黃色的鄰－硝基酚，在很低濃度下也可以檢測出。

（2）培養基：

鄰硝基酚β-半乳糖苷0.6g，0.01mol／L pH7.5磷酸緩衝液1000mL，pH7.5的滅菌1%蛋白腖水300mL。先將前兩種成分混合溶解，過濾除菌，在無菌條件下與1％蛋白腖水混合，分裝試管，每管2～3mL，無菌檢驗後備用。

（3）實驗方法：

取一環細菌純培養物接種在ONPG培養基上置37℃培養1～3h或24h，如有β－半乳糖苷酶，會在3h內產生黃色的鄰硝基酚；如無此酶，則在24h內不變色。

七葉苷水解實驗

（1）原理：

有的細菌可以將七葉苷分解為七葉素和葡萄糖，七葉素與培養基中的枸櫞酸鐵的二價鐵離子反應，生成黑色的化合物，使培養基呈黑色。

（2）應用：

主要用於腸球菌與其它鏈球菌的鑒別，前者陽性，後者陰性，也可用於革蘭氏陰性桿菌及厭氧菌的鑒別。

甲基紅實驗

（1）原理：

細菌分解培養基中的葡萄糖產酸，當產酸量大，使培養基的pH降至4.5以下時，加入甲基紅指示劑而變紅，為甲基紅試驗陽性。若細菌分解葡萄糖產酸量少，或產生的酸進一步轉化為其它物質（如，醇、酮、醛、氣體和水等）則培養基的pH值仍在pH6.2以上，故加入甲基紅試劑呈黃色，為陰性。

（2）實驗方法：

一種細菌的24h培養物，接種於葡萄糖蛋白腖水培養基中，置37℃培養48～72h，取出後加甲基紅試劑3～5滴，凡培養液呈紅色者為陽性，橙色者為可疑，黃色者為陰性。

（3）應用：

主要用於鑒別大腸埃希菌與產氣腸桿菌，前者為陽性後者為陰性。

V-P實驗

（1）原理：

有些細菌能分解葡萄糖產生丙酮酸, 丙酮酸脫羧產生乙醯甲基甲醇，乙醯甲基甲醇在鹼性環境中，被空氣中的氧氧化為二乙醯,二乙醯與培養基內蛋白腖中精氨酸所含的胍基發生反應生成紅色的化合物。若培養基中的胍基含量過少，則可加入少量含胍基的化合物等。

（2）V-P試劑：

肌酸0.3%或原粉，40%的NaOH溶液。

（3）實驗方法：

接種實驗菌於葡萄糖蛋白腖水培養基(與甲基紅實驗相同)中，每次兩個重複，置適溫培養2-6d，取培養液和40%NaOH等量相混，加入少許肌酸，10min如培養液出現紅色，即為實驗陽性反應，有時需要放置更長時間才出現紅色反應。

（4）應用：

本實驗常與甲基紅實驗一起用，因為前者陽性的細菌，後者通常為陰性。

（二）蛋白質和氨基酸的代謝實驗

明膠液化實驗

（1）原理：

某些可以產生一種胞外蛋白水解酶(明膠酶)，能使明膠分解為氨基酸，使明膠失去凝固能力而液化，因而使半固體的明膠培養基成為流動的液體。

（2）實驗方法：

取18～24h的斜面培養物穿刺接種，並有兩支未接種的空白對照。

（3）結果觀察：

於30℃培養20天後觀察，明膠液化的為陽性。由於室溫下明膠培養基呈液狀，因此在觀察結果時，應將其放置於4℃的冰箱中30分鐘後拿出觀察。若明膠仍能全部凝固，為陰性，有部分或全部不能凝固為陽性。

吲哚實驗

（1）原理：

某些細菌具有色氨酸酶，能分解蛋白腖水中的色氨酸產生吲哚，當加入吲哚試劑(對二甲氨基苯甲醛)後則形成紅色的玫瑰吲哚。

（2）培養基：

蛋白腖水培養基。

（3）實驗方法：

將待檢菌接種於富含色氨酸的蛋白腖水培養基中，35℃孵育24~48h，沿試管壁慢慢加入吲哚試劑，觀察結果。

（4）結果：

於兩液面接觸處出現紅色為陽性，無色為陰性。

（5）應用：

主要用於腸桿菌科細菌的鑒定，如大腸埃希菌與產氣腸桿菌，肺炎克雷伯菌和產酸克雷伯菌等的鑒別。

硫化氫試驗

（1）原理：

某些細菌能分解培養基中的含硫氨基酸產生硫化氫，硫化氫遇亞鐵離子或鉛離子則結合形成黑色沉澱物(硫化鐵或硫化鉛沉澱)。

（2）實驗方法：

將待檢菌穿刺接種於醋酸鉛培養基中，於35℃孵育24h -48h，觀察有無黑色沉澱出現。

（3）結果：

培養基變黑為陽性，不變為陰性。

（4）應用：

主要用於鑒別腸桿菌科中屬及種的鑒別，如沙門菌屬、枸櫞酸桿菌屬、變形桿菌屬、愛德華菌屬等為陽性，其它菌屬大多為陰性。但沙門菌屬中亦有部分硫化氫陰性菌株，如甲型副傷寒、仙台、豬霍亂沙門菌等。

尿素分解試驗

（1）原理：

某些細菌具有尿素分解酶，能分解尿素產生大量的氨，使培養基呈鹼性。

（2）培養基：

尿素培養基。

（3）實驗方法：

將待檢菌接種於尿素培養基，於35℃孵育18~24h小時觀察結果。

（4）結果：

培養基呈鹼性，使酚紅指示劑變紅為陽性，不變為陰性。

（5）應用：

主要用於腸桿菌科中變形桿菌屬細菌的鑒定。奇異變形桿菌和普通變形桿菌脲酶陽性，另外雷氏普羅威登菌和摩根菌為陽性，而斯氏和產鹼普羅威登菌陰性。

苯丙氨酸脫氨酶試驗

（1）原理：

測定細菌是否產生苯丙氨酸脫氨酶。細菌產生的苯丙氨酸脫氨酶使苯丙氨酸脫氨後生成苯丙酮酸，加入氯化鐵試劑後產生綠色反應。

（2）培養基：

苯丙氨酸瓊脂培養基。

（3）實驗方法：

將待檢菌大量接種入苯丙氨酸瓊脂培養基中，35℃孵育18~24h，滴加10% 三氯化鐵試劑3~4滴，自斜面上方流下。

（4）結果：

有綠色出現為陽性。應立即觀察結果，延長反應時間會引起退色。

（5）應用：

主要用於腸桿菌科細菌的鑒定。變形桿菌屬、普羅威登菌屬、摩根菌屬均為陽性，腸桿菌科其它細菌均為陰性。

氨基酸脫羧酶試驗

（1）原理：

某些細菌可產生氨基酸脫羧酶，能分解氨基酸使其脫羧生成胺和二氧化碳。由於胺的生成使培養基變為鹼性，可用指示劑指示出來。

（2）培養基：

氨基酸脫羧酶培養基和氨基酸對照培養基。

（3）實驗方法：

將待檢菌分別接種於1支氨基酸(賴氨酸，鳥氨酸或精氨酸)脫羧酶試驗管1支氨基酸脫羧酶對照管(無氨基酸)，各覆蓋至少12.5px高度的無菌石蠟油，35℃孵育1~4d，每日觀察結果。

（4）結果：

對照管應為黃色，若為溴甲酚紫指示劑，則測定管呈紫色則為陽性，若測定管呈黃色為陰性。若對照管呈現紫色則試驗無意義，不能做出判斷。

（5）應用：

主要用於腸桿菌科細菌的鑒別。如，沙門菌屬中除傷寒和雞沙門菌外，其餘沙門菌的賴氨酸和鳥氨酸脫羧酶均為陽性。志賀菌屬除宋內和鮑氏志賀菌外，其他志賀菌均為陰性。

（三）碳源和氮源的利用實驗

唯一碳源利用實驗

（1）原理：

在基礎培養基只提供一種待檢測碳源，若菌株生長則表明菌株能以此種碳源為唯一碳源，否則不能。

（2）培養基：

基本培養基：

(NH4)2HPO41g；NaCl 1g；MgSO4?7H2O 0.2 g；KH2PO40.5 g；瓊脂20g；蒸餾水1000mL；pH7.0-7.2。

各種碳源的終濃度如下：

糖類及其衍生物(醇類，糖苷類等)：1%，w/v；多醇和甘油：1%，w/v；苯甲酸鹽，二酸鹽，其它單酸鹽：0.1%，w/v。糖類及其衍生物和多醇要求過濾除菌，鹽類可加入培養基一起滅菌。

（3）實驗方法：

將純的菌株接種到培養基後培養14~28d，觀察其生長情況，以不加碳源的培養基作對照。能夠生長為陽性。

唯一氮源利用實驗

（1）原理：

在基礎培養基只提供一種待檢測氮源，若菌株生長則表明菌株能以此種氮源為唯一碳源，否則不能

（2）培養基：

基礎培養基：

D-Glucose1g；MgSO4?7H2O0.05 g；NaCl 0.05 g；FeSO4?7H2O 0.001 g；KH2PO4 0.01 g。不同氮源按0.5%的濃度加入。

（3）實驗方法：

將純的菌株接種到培養基後培養14~28d，觀察其生長情況，以不加氮源的培養基作對照。能夠生長為陽性。

（四）各種酶類實驗

氧化酶試驗

（1）原理：

氧化酶(即細胞色素氧化酶)，是細胞色素氧化酶系統中的最終呼吸酶。具有氧化酶的細菌，首先使細胞色素C氧化，再由氧化型細胞色素C再使對苯二胺氧化，生成有色的醌類化合物。因此，本試驗結果與細胞色素C的存在有關。

（2）實驗方法：

菌落法：直接滴加試劑於被檢菌落上；濾紙法：取潔凈濾紙一小塊，蘸取菌少許，然後加試劑；試劑紙片法：將濾紙片浸泡於試劑中製成試劑紙片，取菌塗於試劑紙上。

（3）結果：

細菌在與試劑接觸10秒內呈深紫色，為陽性。無色為陰性。為保證結果的準確性，分別以銅綠假單胞菌和大腸埃希菌作為陽性和陰性對照。

（4）應用：

主要用於腸桿菌科細菌和假單胞菌屬的鑒別，前者陰性，而後者陽性。奈瑟菌屬、莫拉菌屬細菌也呈陽性反應。

過氧化氫酶試驗(觸酶試驗)

（1）原理：

具有過氧化氫酶的細菌，能催化過氧化氫成為水和原子態氧，繼而形成氧分子，出現氣泡。

（2）實驗方法：

取潔凈玻片1張，用接種環挑取細菌，加3%過氧化氫數滴，立即觀察結果。

（3）結果：

若立即出現大量氣泡為陽性。無氣泡為陰性。

（4）應用：

革蘭陽性球菌中，葡萄球菌和微球菌均產生過氧化氫酶，但鏈球菌科陰性，故該試驗常用於革蘭陽性球菌的初步分群。

硝酸鹽還原實驗

（1）原理：

硝酸鹽還原反應包括兩個過程：一是在合成代謝過程中，硝酸鹽還原為亞硝酸鹽和氨，再由氨轉化為氨基酸和細胞內其它含氮化合物；二是在分解代謝過程中，硝酸鹽或亞硝酸鹽代替氧作為呼吸酶系統中的終末受氫體。硝酸鹽還原過程可因細菌不同而異。有的細菌僅使硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，如大腸埃希菌等；有的細菌可使其還原為亞硝酸鹽和離子態的銨；有的細菌能使硝酸鹽或亞硝酸鹽還原為氮，如假單胞菌；有的細菌還可以將其還原產物在合成性代謝中完全利用。

（2）實驗方法：

將待檢菌接種於硝酸鹽培養基(內含小倒管)中，35℃孵育1~4d。將甲、乙等量混合液(用時混合)(約0.1ml)加於試管內，立即觀察結果。

（3）結果：

出現紅色為陽性反應。若加入試劑後無顏色反應，可能是：

硝酸鹽沒有被還原，試驗陰性；

硝酸鹽被還原為氨和氮等其他物質而導致假陰性結果，這時應在試管內加入少許鋅粉，如出現紅色則表明試驗確實為陰性。若仍不產生紅色，表明試驗為假陰性。

若要觀察是否有氮氣產生，可於培養基管內加1隻小導管，有氣泡產生，則表示有氮氣生成。

（4）應用：

本試驗廣泛用於細菌鑒定。腸桿菌科細菌均能還原硝酸鹽為亞硝酸鹽;銅綠假單胞菌、嗜麥芽窄食單胞菌等假單胞菌屬均可產生氮氣；有些厭氧菌如韋榮菌等試驗也為陽性。

澱粉酶實驗

（1）原理：

有些細菌具有合成澱粉酶的能力，可以分泌胞外澱粉酶，澱粉酶可以使澱粉水解為麥芽糖和葡萄糖，澱粉水解後遇碘不在變藍。