青島能源所在藍細菌光合生物合成乙醇方面取得系列進展

圖1. 採用BICCS補碳策略提高培養體系pH值以抑制雜菌污染並恢復乙醇合成

圖2. 藍細菌乙醇光合工程藻株的實驗室培養和戶外規模化培養

乙醇是生產規模最大、應用程度最高的可再生生物液體燃料。現階段，生物乙醇的主要來源是採用含糖量豐富的農業生物質為原料的生物煉製過程，以「玉米乙醇」最具代表性，然而其「與糧爭地、與人爭糧」的原料供應模式引發了極大的社會爭議；以木質纖維素等農業、林業廢棄物為原料的纖維素乙醇合成技術緩解了「糧食乙醇」在原料供應上的不足，但是纖維素原料的預處理及酶解糖化過程需要消耗大量能量、水和纖維素酶，從而極大地拉高了生產成本。與生物煉製過程相比，通過光合微生物平台將二氧化碳和太陽能直接轉化為乙醇的技術路線（CO2 To Ethanol, CTE）減少了原材料預處理、底物提煉過程的損耗，也節省了對淡水和用地的需求，在經濟性與可持續性上表現出更大的潛力與優勢。

中國科學院青島生物能源與過程研究所微生物代謝工程團隊在藍細菌光合生物合成乙醇技術方面取得了系列研究進展。該團隊以重要的模式藍細菌集胞藻PCC6803（Synechocystis sp. PCC6803）為底盤藻株，將來自運動發酵單胞菌的PdcZM-AdhIIZM（丙酮酸脫羧酶-II型醇脫氫酶）途徑導入PCC6803，打通了乙醇光合合成路線，實現了工程藻株中乙醇的合成與分泌；針對藍細菌生理和代謝背景特性分析，使用來自集胞藻PCC6803自身的NADPH依賴型的II型醇脫氫酶基因slr1192替換AdhIIZM後，成功地優化了乙醇合成途徑與底盤藻株的適配性，使乙醇產量提高了50%；在此基礎上結合競爭性途徑敲除和代謝途徑拷貝數強化等策略，最終獲得了具有較強乙醇光合合成能力的工程藻株Syn-HZ24，在柱式反應器中經過28天培養後，乙醇產量達到5.5g/L，合成速率0.2g/L/day，處於國際領先水平。上述結果奠定了該團隊在藍細菌乙醇方向上的研究基礎，已經發表於《能源與環境科學》（Energy & Environmental Science，Gao, et al, 2012, 5:9857–9865）。

為了進一步提升藍細菌工程藻株乙醇光合合成的潛力，該團隊採用體外重構和動態分析的策略對新發展的PdcZM-slr1192途徑的催化特性進行了深入挖掘。首先脫離複雜的胞內環境在胞外重新構建該途徑，以純化後的酶（PdcZM/slr1192）、底物（丙酮酸，Pyruvate）、輔因子（NADPH/NADH/TPP）、金屬離子（Mg2+）以及中間產物（乙醛，acetaldehyde）對整個途徑的催化效率影響分別進行定量的滴定分析，結果發現影響乙醇合成的限制因素是PdcZM而非slr1192；在總蛋白濃度設置恆定的條件下，PdcZM-slr1192的濃度比為4:6時，全途徑具有最大的乙醇合成催化活性。為了驗證Cell free條件下獲得的結果，研究人員在集胞藻PCC6803中構建了PdcZM-slr1192濃度配比不同的工程菌株，通過代謝工程結合酶活與蛋白含量分析實驗，證實了現有工程藻株中PdcZM的表達量和活性是乙醇合成能力的首要限制因素。此外，體外重構體系中的滴定數據結合藍細菌胞內代謝物的實際含量分析還顯示，提高NADPH和丙酮酸的供應量也應該是提高乙醇合成效率的重要選擇。上述結果明確了藍細菌乙醇光合工程藻株進一步改造的方向，已經發表於生物能源期刊Biotechnology for Biofuels（Luan, et al, 2015, 8:184）。

基於已經開發的藍細菌乙醇光合工程藻株，該團隊又進一步探索了光合細胞工廠的擴大化培養技術。光合生物製造通常在戶外、開放式、未滅菌的條件下進行，因此經常面臨各種模式的生物污染的嚴重威脅進而導致擴大培養的失敗。研究人員在進行工程藻株Syn-HZ24的開放式、規模化培養中發現，其乙醇合成與積累過程受到了微生物污染的嚴重影響。通過分析和鑒定，確定了Pannonibacter phragmitetus為乙醇光合合成的主要威脅來源，該菌可以以乙醇為唯一碳源進行生長，迅速消耗工程藻株合成的乙醇並在培養體系中大量增殖。通過對Pannonibacter phragmitetus和Syn-HZ24的生理和生化分析，研究人員提出提高培養體系pH值來抑制Pannonibacter phragmitetus侵染並恢復乙醇光合合成的設想（Bicarbonate-based Integrated Carbon Capture System, BICCS），並在實驗室柱式反應器和戶外薄膜掛袋兩種體系下進行了驗證，結果表明該策略可以有效解決Syn-HZ24在開放式培養過程中的生物污染問題，在規模化培養9天後乙醇產量達到0.9g/L，而常規pH條件下的對照體系中無乙醇積累。此部分工作鑒定了一種工程藍細菌規模化培養過程中新的生物污染模式，並針對性地設計、驗證了解決方案，對光合細胞工廠培養的工程化、規模化發展有普遍的借鑒意義。該工作近期發表於Biotechnology for Biofuels（Zhu, et al, 2017, 10:93）。

上述研究獲得國家自然科學基金、「863」計劃、山東省泰山學者項目、山東省自然科學基金以及青島市創新領軍人才項目的支持。

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