中國期刊一哥里的心血管研究新思路

作者：葉子（轉載請註：解螺旋·醫生科研助手）

上周文獻精讀選取的文章是來自於Cell Research的一篇有關心血管文章，文章的標題是「Direct reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocytes with chemical cocktails」。（回復0426可下載文獻）翻譯成中文就是「利用化合物雞尾酒法誘導小鼠成纖維細胞重編程為心肌細胞」，這篇文章和傳統的心血管研究思路有所差別，從中可以得到一些新的啟發。

科學假說

本文的科學假說主要是根據已有的文獻報道：

1、小分子化合物化合物組合能夠調控細胞命運轉變；

2、已經報道利用小分子化合物組合能夠誘導成纖維細胞重編程為多能幹細胞；

3、本文探索是否能夠利用小分子化合物誘導體細胞直接重編程為心肌細胞

PS: 圖片中虛線部分，可作為其他研究方向，展開研究

結果解讀

本文主要包括4個Fig，這是典型的Nature風格。Cell Research目前也是國內頂級的生物學類期刊，影響因子最高到了14.8，國內的研究成果發到Cell Research基本上能和國際上的主流期刊媲美。

Fig1主要是介紹了發現的現象，誘導體系建立；

Fig2對心肌細胞的功能進行了鑒定；

Fig3為了更好的將現象和鑒定出來的結果進行驗證，作者採用了遺傳示蹤技術；

Fig4對於以上的結果進行了初步的機制解析，這裡簡單的進行了細胞學機制的解析。

Fig1：如何發現並確定現象

Fig1中主要是說小分子化合物組合可以直接誘導小鼠成纖維細胞重編程產生自我跳動能力。

Fig1A介紹了整個誘導重編程的流程圖，先是把小鼠的成纖維細胞通過兩個階段的不同培養基和化合物的處理，產生了心肌細胞。

Fig1B中小分子化合物組合CRFVPT處理後不同時間點的小鼠胚胎成纖維細胞（MEF）形態變化。

在顯微鏡中可以觀察到，這些細胞類似於心肌細胞的棒狀結構，同時具有跳動能力，像心肌細胞一樣在那裡一張一縮。從這個現象就確定了整個誘導過程是有可能產生心肌細胞的。

Fig1E是在小分子化合物組合CRFVPT處理後14天後的小鼠尾尖成纖維細胞（TTF）形態變化。

這裡有個問題，從什麼階段產生這種有跳動能力的細胞呢？作者進行了時間點的觀察，發現在第8天就已經產生了有跳動能力的細胞，在5萬的細胞中有10多個細胞跳動，到20天就有100個細胞，效率已經很高了。

Fig1D小分子化合物組合CRFVPT的精簡，可以發現在去除了CHIR99021、RepSox、Forskolin、VPA後誘導效率就大大的打了折扣。

做了減法後，開始做加法，看看在原來的化合物里增加一些處理能不能提高誘導效率。

Fig1F：在第二階段中添加不同因子後誘導TTF產生跳動克隆的作用效果

發現加入NRG1、G-CSF兩個因子後，可以使細胞產生的效率進一步提高，兩者合用效果也會更好。小分子化合物組合CRFVPT聯合Rolipram的作用效果（Fig1G）。

然後作者要檢測培養出來的是不是真的心肌細胞，在小分子化合物組合處理MEF後24天檢測跳動細胞克隆中心肌細胞的標誌物，包括Mef2c、Gata4、Nkx2.5、α-MHC、α-actinin、cTnT、cTnI、N-cad和Cx43。

基本上可以確認這個方法可以把小鼠成纖維細胞轉變成具有跳動能力的心肌樣細胞。

Fig2：對產生的心肌細胞進行完全的鑒定

Fig2A就是對MEFs、MEF-CiCMs (化合物誘導24天後的跳動細胞克隆) 與心肌細胞的基因表達譜進行分析。Fig2B是對表達水平變化大於5倍以上基因的功能分析（GO）。

接下來對心肌細胞特有的第二特徵進行鑒定，首先是鈣流實驗。

Fig2C：MEF-CiCMs（25天）鈣流檢測；Fig2D：MEF-CiCMs（25天）鈣流頻率檢測；Fig2D：MEF-CiCMs（25天）鈣流消退檢測。

之後進行電生理檢測。

Fig2F：MEF-CiCMs 的電生理檢測

Fig2G：免疫熒光技術檢測MEF-CiCMs 中MLC2a、MLC2v、α-actinin和HCN4表達

Fig2H：MEF-CiCMs 的電生理檢測參數統計

Fig3：譜系示蹤法驗證

構建Fsp1-Cre:R26RtdTomato背景的遺傳示蹤小鼠示意圖

Fsp1-Cre:R26RtdTomato背景小鼠來源的MEF在小分子化合物組合CRFVPT處理24天後，檢測紅色熒光（tdTomato）與不同心肌細胞標誌物是否共定位。包括：Mef2c、NKX2.5、α-actinin、cTnT、cTnI和α-MHC。

然後又是一套鈣流啊，電生理實驗，可以證明CiCMs可以誘導小鼠成纖維細胞重編程為心肌細胞。

Fig4：細胞機制的解析

利用Oct4::GFP報告系統，檢測化合物誘導重編程過程是否產生iPSCs。可以發現，從1-26天都沒有產生陽性信號。

Fig4B用RT-PCR檢測不同化合物誘導時間段的心肌祖細胞標誌物基因表達水平，包括：Sca-1、Abcg2、Wt1、Flk1和Mesp1。

Fig4C用免疫熒光染色檢測Sca-1陽性細胞及其分化為平滑肌細胞和內皮細胞。

套路分析

如果想進一步檢測，第一個可優化就是鑒定RNA-Seq，代替基因表達譜。第二可以從Sigma，Selleck，Tocris等一些公司購買小分子的化合物庫，加在CRFV基礎上，看看是促進還是抑制。

最後，心肌細胞不僅可以用於篩葯，還能在心血管疾病的動物模型上注入心肌細胞，來觀察對於不同心血管疾病動物模型的改善情況。

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