用人體幹細胞改造豬胚胎，產出人體器官

通過把人源幹細胞注入經過基因改造的豬胚胎，再將胚胎移殖到代孕母豬子宮內發育3~4周，科學家已經能夠培育長著人體器官的豬胎。未來幾十年，用動物胚胎生產人類器官或將成為現實，移植器官的來源將不再像今天這樣匱乏。

撰文 胡安 · 卡洛斯 · 伊斯皮蘇亞 · 貝爾蒙特（Juan Carlos Izpisúa Belmonte）

翻譯 陳鳳嬌

審校 楊海元

每年，全球都有成千上萬的人接受器官移植。雖然器官移植技術發展迅速，然而有限的捐獻器官數量，卻限制了器官移植治療。全球範圍內的數據難以統計，但僅在歐洲，平均每天就有16位需要器官移植的病人在等待心臟、肝臟或者其他器官的過程中死亡，而在美國，這一數字更是達到了22。更令人擔憂的是，等待器官移植的病人數量與捐獻的器官數量之間的差距，每年都在增加。

緩解捐獻器官短缺的一種潛在解決方案是，在實驗室中生產人類器官的替代品。幾年前，科學家認為，可以利用具有祖細胞特性、可分化形成各種不同組織的幹細胞，結合人工器官支架，來構建新器官。然而，如何在體外實現對幹細胞發育的精確調控，從而獲得具有完整功能的人類器官，是研究人員面臨的巨大難題。目前關於這方面的研究仍在繼續，但是進展相當緩慢。

因此，包括我在內的一小部分研究者認為，構建人體器官需要另闢蹊徑，即利用胚胎髮育的天然機制來實現突破，這一觀點也逐漸被越來越多的科學家所認同。不論是小鼠還是人類，胚胎髮育演化出一套精確而巧妙的機制，即由少量完全相同的細胞發育分化成不同的器官或組織，最終組裝成完整的複雜生物體。動物胚胎的發育出現在受精卵形成後的數周至數月，不依賴人工支架就可生成具有心臟、肺、腎臟及其他功能組織的完整動物。因此，我們相信，能找到一種方法，從豬等動物體內收穫器官，供人體使用。

當然，一顆正常的豬心臟並不能直接移植給人。首先，人體自身的免疫系統會極力排斥這樣一顆完全跨物種的移植物（豬的心臟瓣膜必須經過化學處理，阻斷免疫反應後，才能用作人心臟瓣膜的替代物，否則人的免疫系統將破壞整個器官的功能）。我和同事認為，在豬、牛等動物體內，生成完全或者大部分由人源細胞構成的人類器官，是有可能的。這也意味著可能培育出嵌合體動物，即同時由兩種不同生物的組分構成的生命體，就像希臘神話中的格里芬（griffin，一種鷹頭獅身有翅的怪獸）一樣。我們夢想著通過將人源幹細胞注入精心改造後的動物胚胎內，待其充分發育成熟，獲得包含由人類細胞發育而來的器官的嵌合動物。然後，就可以收穫人源的心臟、肝臟或者是腎臟，提供給那些需要器官移植的病人。

這種想法聽起來有點像天方夜譚，但可行性已經被美國和日本的科學家大體上證實了。研究者將大鼠的幹細胞注射到經過改造的小鼠胚胎內，之後將嵌合胚胎移植到代孕小鼠體內，經過數周的妊娠，代孕母鼠生產出外觀及行為上均與小鼠無異，卻擁有大鼠胰髒的嵌合體動物。我的實驗室以及其他課題組的研究人員，已經在此實驗基礎上開展了進一步研究，即將人源幹細胞注射進豬的胚胎中。通過數例幹細胞注射實驗，我們已經證實，人源組織可以在豬胚胎內發育。然後，我們將嵌合胚胎移植入代孕母豬子宮內，讓胚胎髮育3～4周。在獲得更多的中期實驗數據支持後，我們將使嵌合胚胎在代孕母豬子宮內的發育時間延長至數月，那時就可以鑒定出嵌合體胚胎中人源細胞所佔的比例。一旦上述實驗獲得成功，並且美國政府以及地方當局批准我們繼續實驗，我們預期能夠使嵌合胚胎生長到足月（對於豬來說，妊娠期約為4個月）。

當然，要最終培育出嵌合體小豬，我們還有很長的路要走。為了讓嵌合胚胎安全度過整個妊娠期，我們還需要探索如何製備更好的人源幹細胞和更適合接受注射的動物胚胎，整個實驗進程將困難重重。然而，即使我們最終未能得到完整的器官，構建嵌合體胚胎的這項研究，也可以幫助我們更好地了解包括癌症在內的很多複雜、毀滅性疾病的發生、發展以及臨床表現。如果這項技術獲得了成功，將會對器官移植領域產生深遠影響。我們將能夠在農場動物身上大量生產人類器官的替代品，供給全球成千上萬急需器官移植治療的病人，病人排隊等候移植器官的場面將成為過去。

跨越物種障礙

近幾年，生物學家對胚胎的發育機制有了非常深入的研究，我們已經能在一定程度上，對胚胎髮育過程進行調控。我們也很清楚，在發育著的生物體內，不同類型的幹細胞所在的位置、所處的時間階段，對胚胎的生長是至關重要的。細胞在胚胎的不同區域會生成、釋放不同濃度的生長因子；反過來，不同濃度的生長因子又會激活或抑制特定區域內的遺傳程序，進而實現對胚胎髮育的調控。基於這些尚不完全的認識，以及大量的實驗與摸索，我們和其他一些研究人員希望操控豬的胚胎的發育，讓它們長出人的組織，產生腎臟、胰腺等可供移植的器官。

我們所用的原材料包括豬的卵子、精子（從豬身上採集），以及人的幹細胞（通過實驗室培養得到）。我們首先在體外使豬的卵子受精，形成合子（zygote），合子在幾個小時後開始分裂成兩個細胞，然後再次分裂成看起來完全相同的4個細胞。每個細胞都會激活相同的一些基因，產生一系列蛋白質，誘導細胞進一步分裂增殖。

由於基因和蛋白之間複雜的相互作用，這些曾經完全相同的細胞一旦再分裂後，便會開始移動，行使不同的功能。僅僅在幾天之內，由受精卵分裂而來的數百個細胞，會形成一個大球套小球的結構，即我們所說的囊胚。這個階段是我們注射人源幹細胞的最晚階段——也就是說，要在特化組織，即隨後會發育為特定功能器官的原基（primordia）開始形成之前注射幹細胞。如果再遲一點注射，受體胚胎里原有的幹細胞將不能促使外來的人源幹細胞發育，人源幹細胞最後會萎縮死亡。

隨著發育的進行，胚胎會形成外、中、內3個胚層，每一個細胞在胚胎上的精確定位變得空前重要。例如，之前的研究已經證明，內胚層的某些細胞會對它們所在的微環境中的蛋白信號作出應答，啟動Pdx1基因的表達。而這個基因的表達，又會激活更多基因，促進胰髒的發育。而在中胚層的少數細胞，則會在外部信號的作用下，啟動Six2基因的表達，讓腎臟開始形成。由此可見，在生物個體中，即使所有細胞的基因組序列一樣，但每個細胞在特定發育階段所處的微環境，決定了細胞會選擇性地開啟或關閉哪些基因的表達，進而決定這些細胞會發育形成哪些組織和器官。

找到像Pdx1或者Six2這樣，能夠開啟一條完整的信號通路，從而控制胰臟或腎臟發育的單個基因，對我們的研究來說非常關鍵。我們實驗室的研究人員通過刪除控制胰髒髮育的關鍵基因，培育出了無法形成胰腺的豬胚胎——除非我們向豬胚胎注射了足夠多的、含有那種關鍵基因的人源幹細胞。如果注射的人源幹細胞能夠順利地在這種豬胚胎內發育，就能在豬體內形成成熟的、完全由人類細胞構成的器官。最理想的結果是，動物的其他部分均由豬的細胞發育而來。

由於胚胎髮育涉及很多科學問題，要準確刪除胚胎中的關鍵基因，然後用其他物種的幹細胞彌補由此產生的缺陷，科學家首先需要在嚙齒類動物中做很多實驗。2010年，日本東京大學的中內宏光（Hiromitsu Nakauchi）和同事率先取得了突破，他們成功讓小鼠長出了大鼠的胰臟。最近，我們實驗室將大鼠的幹細胞注射進經過基因改造的小鼠胚胎中，讓嵌合胚胎在代孕小鼠體內經過3個星期的發育，獲得了眼部帶有大鼠細胞的小鼠胎兒。

選中豬胚胎

科學研究的旅程從來不會一帆風順，需要認真考量所有可能存在的問題。小鼠的體型太小，不可能長出可以移植給病人的器官，所以我們目前的研究重點主要放在豬胚胎上。豬及豬的器官可以生長到不同尺寸，幾乎可以滿足臨床上各種體型的病人的需要。與小鼠相比，豬的妊娠期更長（小鼠妊娠期約20天），但還是短於正常人類胚胎9個月的發育時間。所以研究人員正在探索新的生化方法，撥快人源幹細胞發育的生物鐘，使其成熟、分化的進程與受體動物胚胎的發育進程相匹配。顯而易見的是，將人源幹細胞的發育進度調整到與豬胚胎同步，要比調整到與小鼠胚胎同步容易得多。

最近，我和同事正在努力構建由人源細胞構成的胰臟或腎臟。選擇胰臟或腎臟作目標，是因為這些器官的胚胎髮育由單個關鍵基因控制，刪除單個基因相對簡單。而像心臟等其他器官，可能需要依靠更多的基因來啟動發育進程，這意味著需要敲除不止一個基因，這比敲除單個基因要難得多。讓人欣慰的是，最近哈佛大學喬治·丘奇（George Church）領導的科研團隊，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術，在胚胎中成功敲除了位於不同位置的多個基因，這為研究人員對胚胎進行複雜的基因編輯提供了借鑒。

另外，我們需要確保用於注射的人源幹細胞的「乾性」足夠好，也就是說，人源幹細胞要具有生成任何組織的潛能。生物學家將這種幹細胞的生理狀態稱之為「發育水平上的原初狀態」（developmentally naive）。從體外受精的受精卵中獲得的人源胚胎幹細胞，其乾性是符合實驗要求的。但是，這種幹細胞的應用存在巨大的倫理爭議。

過去十年里，科學家在幹細胞研究上不斷突破，iPS技術似乎是解決上述難題的鑰匙。iPS即誘導多能幹細胞，是通過一些生物技術，讓皮膚或是小腸的成熟細胞返回幹細胞狀態而得到的一種細胞類型。用人源iPS代替人源胚胎幹細胞進行試驗操作，在倫理上更容易被接受。iPS的另外一個優勢是可以製造出與病人在遺傳、免疫上完全匹配的器官。

然而，深入的研究發現，目前製得的iPS並非處於發育的原初狀態，這也是人源iPS無法在嵌合胚胎中存活下來的原因。人源iPS不具備全能性，就不能響應任何來源於胚胎髮育過程中的生化信號，不能發育成胚胎需要它們發育成的組織類型。胚胎會將這些不能正確接受胚胎整體調控的iPS視為異己，產生排斥反應。

最近，我們實驗室的吳軍（Jun Wu）獨闢蹊徑，嘗試用一組生長因子來處理人的iPS。處理後的部分細胞，已經可以對來自胚胎髮育過程中的很多信號進行應答。目前的初步結果顯示，經過處理的人源iPS能夠整合到囊胚。我和同事在胚胎髮育的不同時間點終止其發育，並在顯微鏡下觀察受體細胞和供體細胞的融合程度。接下來，我們打算讓胚胎髮育到受精後6周，也就是在可以看到原基的時候再進行觀察和分析。到那個時候，胚胎將開始產生最終會發育成動物體各種組織、器官的祖細胞。

即使我們能培養出可完全整合進豬胚胎的人源iPS，也不意味著我們成功在望。小鼠和大鼠的嵌合體雖然已經構建成功，但人和豬在進化上相距更遠，人和豬的嵌合體也許難以實現。人源iPS也可能無法應答來自於豬胚胎的某些生化信號。如果不能解決這個難題，我們也許就要開始考慮用牛或其他物種來開展試驗。

監管下的實驗進展

2012年，我與何塞普·瑪麗亞·坎皮斯托爾（Josep Maria Campistol）詳細討論了關於嵌合體生成人類器官的一些問題。坎皮斯托爾是國際知名的器官移植醫院——巴塞羅那醫院（Hospital Clinic of Barcelona）的院長。對於他的建議，我至今印象深刻，他說：「要想確定人的iPS能否跨越物種障礙，最終在豬的體內發育成人的器官，唯一的辦法就是挽起衣袖，進行實驗。」

坎皮斯托爾的話激勵我埋頭實踐。我們知道單靠自己不可能完成這個艱巨的任務。於是，我們實驗室與眾多的胚胎學家、獸醫、幹細胞生物學家以及生物倫理學家成立了一個國際聯盟，來一起驗證我們的觀點。2015年，我們就開始在豬的胚胎里注射人的iPS。在此，我要特別感謝西班牙聖安東尼奧天主教大學（San Antonio Catholic University）以及Moxie基金會對我們早期工作的大力支持，那個時候甚至沒有人認為我們的方法是可行的。

到目前為止，我們的大部分工作都是在美國加利福尼亞州和西班牙開展的，而且所有的工作都在當地或兩國監管部門的監管下進行。現階段，我們允許豬-人嵌合胚胎在母豬子宮內發育約4個星期，然後我們會處死動物，進行研究分析（根據我們與監管部門制定的協議，代孕母豬和嵌合胚胎需要共同處死）。

總之，這些實驗以及其他實驗獲得的數據，幫助我們了解了關於嵌合胚胎髮育的一些基礎知識。我們正著手研究人源iPS細胞注射到豬胚胎中的最佳數量以及最佳時間。除此之外，我們還開始追蹤人源細胞遷移到豬胚胎不同部位的具體路徑。

幾十年後，將成現實？

在不斷優化實驗步驟的同時，研究人員也必須要跟公眾一起來處理這個新領域所產生的一些倫理、社會以及監管上的挑戰。我們團隊與加利福尼亞州還有西班牙的倫理學家、監管部門一起工作了一年半，制定了一系列規章制度來監管我們的實驗。

毫無疑問，在用任何有感覺的動物進行研究時，我們都應該遵守關於動物福利的相關規定，比如盡量減少動物不必要的痛苦，給動物提供充足的生存空間，保證它們的正常活動等。然而，我們開展的嵌合動物研究，還會面臨一些特殊問題。就像前面提到的，真正最原始的幹細胞具備發育成任何組織類型的潛能。因此，我們必須要特別關注以下3種組織——神經、精子和卵子，因為在動物體內產生這3種人源組織是任何人都不希望看到的。

想像一下，如果豬的大腦充滿了大量的人類神經，那麼豬將擁有更高級別的感知能力，如果這種情況發生，對我們來說將是一場噩夢。未雨綢繆的做法是注射前將人源iPS中編碼神經發育的相關基因刪除，這樣即使人源iPS在豬胚胎髮育過程中遷移到大腦發育的微環境中，它們也不能繼續發育。最終，豬的神經必須由豬的細胞發育而來。

除此之外，研究人員必須注意的另一個問題是，避免嵌合體動物之間的相互繁殖。雖然可能性很小，但是風險還是存在：我們注射進動物胚胎的人源幹細胞不僅會遷移到我們預定器官的發育微環境，也可能進入動物生殖系統的微環境。這種情況造成的後果就是嵌合動物可以產生人類精子和卵子。如果讓這些嵌合體動物之間相互繁殖，將會在倫理上造成災難性的後果：人類的胚胎（由一頭嵌合體豬產生的人源精子和另一頭嵌合體豬產生的人源卵子結合而成）將會在動物體內孕育。要避免此類麻煩出現，最好的辦法就是確保用來生產移植器官的嵌合動物每次都是「重新構建」的，也就是說，每次都用一頭豬的卵子和另一頭豬的精子體外受精後得到豬的囊胚，再注射人源幹細胞。

當然，如果技術上的難題我們無法克服，所有這些擔憂都屬於杞人憂天。但是即使我們不能構建出可供移植的有功能的器官，我相信整個實驗過程中探索出來的知識和技術，仍具有巨大的價值。這些知識與技術將首先惠及腫瘤研究領域。研究顯示，許多不受控制的腫瘤之所以會在兒童或者成人體內生長，就是因為一些（不是全部）調控胚胎髮育到胎兒階段的基因，在腫瘤組織中被重新激活了。因此，研究人員對胚胎髮育的正常細胞信號通路了解得越清楚，就越容易抑制腫瘤細胞的惡性增殖。

當然，科學家也是普通人。我們會為科學研究中湧現出的新想法、新技術感到興奮，也可能對我們研究成果的意義、我們所從事的研究，甚至對整個人類的未來過於樂觀了。但是，根據我在本文中所提到的一些前期的研究成果，我確實有理由充滿期待——在未來的幾十年里，用嵌合體動物胚胎生產人類器官是有可能實現的。

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