定向合成代謝助力新萜類化合物井噴式發現

近日，代謝工程領域頂級期刊 Metabolic Engineering《代謝工程》（影響因子：8.201）在線發表武漢大學藥學院鄧子新院士團隊劉天罡教授課題組的最新研究成果《高效的萜類化合物底物供給平台助力釋放萜類環化酶生物合成潛力》（Releasing the potential power of terpene synthases by a robust precursor supply platform）。該項研究成果是劉天罡教授提出的「定向合成代謝」（Targeted Anabolism）理論技術體系的又一突破性研究成果。該工作將合成生物學和代謝工程的應用範圍拓展到天然產物挖掘領域。這一新策略的提出使得萜類骨架化合物及其生物合成元件的挖掘速度取得了突破性的進展，可以在很大程度上避免對已知化合物的重複挖掘。同時也使得人們對萜類合酶生物合成能力的認識提升到一個新的高度，具有廣泛的應用性。

萜類化合物是最重要的一類天然產物，著名的青蒿素和紫杉醇都屬於這一家族。然而，目前研究人員對萜類化合物生物合成相關元件的挖掘還遠遠不足。其中，萜類環化酶（terpene cyclase）能夠催化不同鏈長的異戊二烯單元合成單環或者多環的萜類化合物核心骨架，是萜類化合物結構多樣性的基礎。因而，挖掘新的萜類環化酶是拓展萜類化合物結構多樣性的一個決定性步驟。傳統的天然產物挖掘方法通常受限於自身或異源表達宿主的產物合成能力，僅能對其中主要產物進行挖掘鑒定，在很大程度上掩蓋了萜類環化酶的生物合成潛力。因而，開發一個高效的萜類化合物生物合成元件及其產物挖掘平台是加速萜類化合物相關研究進程的關鍵所在。

為此，劉天罡教授課題組對絲狀真菌來源的I型萜類環化酶進行系統發育分析，發現第三個（clade III）進化分支上的萜類環化酶具有底物及反應雜泛性（promiscuous）的潛質。研究人員從絲狀真菌Fusarium graminearum J1-012基因組中篩選出兩個沉默表達的位於 clade III進化分支的萜類環化酶FgMS和FgGS。體外反應結果顯示兩個酶具有空前的底物和反應雜泛性，能夠以香葉基焦磷酸（GPP）、法尼基焦磷酸（FPP）、香葉基香葉基焦磷酸（GGPP）以及香葉基法尼基焦磷酸（GFPP）為底物合成多種類型的萜類化合物。且其中的FgMS是一個嵌合酶（chimeric enzyme），同時具有萜類環化酶和異戊烯基轉移酶（prenyl

transferase）結構域，能夠以異戊烯焦磷酸（IPP）和烯丙基焦磷酸（DMAPP）為底物合成不同鏈長的萜類化合物。隨後，研究人員在前期對萜類化合物「定向合成代謝」深刻認識的基礎上，構建了一個含有3個不同模塊（底物供給模塊，不同異戊二烯前體合成模塊，萜類合酶模塊）的萜類化合物組合生物合成平台，研究兩個酶合成萜類化合物的潛力。最終結果顯示，他們能夠合成多達50種單萜、倍半萜、二萜以及二倍半萜化合物。對其中的12個產物進行鑒定並從中篩選出7個新的二萜和二倍半萜化合物，其中包含有3個新骨架化合物（圖1）。顯示了兩個酶強大的萜類化合物合成能力以及該組合生物合成平台的高效性。

圖1. 組合生物合成策略指導的具有底物及反應雜泛性萜類環化酶及新（骨架）產物的高效挖掘

為了加速萜類化合物挖掘進程，研究人員對其中的FgMS進行同源建模，並對其活性口袋附近潛在的非保守氨基酸位點進行分析並開展理性的定點突變。

體外研究結果顯示，F65L和F159G位點的突變能夠賦予FgMS新的產物合成能力，合成6個潛在新的二倍半萜化合物，這將在很大程度上豐富有限的二倍半萜化合物骨架的數量。隨後研究人員對其中1個主要產物進行發酵、純化並鑒定其為新的二倍半萜類化合物。該組合生物合成結合酶的理性改造策略使得研究人員能夠充分挖掘FgMS和FgGS的生物合成潛力。相較於傳統的天然產物挖掘手段，發現的新（骨架）化合物的數量和效率得到了極大的提升。

圖2. 酶的理性改造加速萜類化合物挖掘進程

此外，研究人員對通用蛋白資料庫（UniProt）中真菌來源的I型萜類環化酶進行系統發育分析，從中篩選得到321個位於clade III的萜類環化酶，為後續具有潛在底物及反應雜泛性萜類環化酶及新產物的挖掘指明了方向。將極大地加速新的萜類化合物生物合成元件及產物的挖掘進程並加深我們對該類萜類環化酶的認識。該策略還可以快速推廣到其它天然產物的挖掘進程中去，將有望顛覆傳統的天然產物挖掘方式。論文的研究工作主要由博士生卞光凱和武漢臻智生物科技有限公司工程師韓以超（共一作）等完成。

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