哈工大最新Nature！揭示Anti-CRISPR蛋白抑制SpyCas9活性的分子機制

本文轉自哈爾濱工業大學，原標題：黃志偉課題組在《自然》發表論文揭示Anti-CRISPR蛋白抑制SpyCas9活性的分子機制。

4月28日，哈爾濱工業大學生命學院黃志偉教授課題組在《自然》（《Nature》）在線發表了題目為《Anti-CRISPR蛋白抑制CRISPR-SpyCas9活性的分子機制》（Structural basis of CRISPR-SpyCas9 inhibition by an anti-CRISPR protein）的研究論文。

CRISPR-Cas系統是細菌編碼的用來保護細菌免受噬菌體感染的適應性免疫系統，該系統通過crRNA引導的Cas核酸酶剪切入侵病毒的DNA或者RNA從而防禦病毒感染。由於CRISPR-Cas系統與sgRNA組合具備高效、便捷「編輯」目的DNA的能力，CRISPR II-A亞型系統之一的鏈球菌Cas9（SpyCas9）系統已被廣泛應用於全世界範圍內的生物醫學研究以及基因治療領域，進行細胞、組織或個體內DNA的敲除、激活、修飾、突變等，而且該系統已經成為目前最重要的、也是最廣泛使用的基因編輯工具。

但是，如何減少SpyCas9過度激活或者長時間活性帶來的基因編輯脫靶效應，以及如何對SpyCas9的活性進行時間、空間或條件性的精確控制，是當下SpyCas9系統用於細胞或組織基因編輯、基因治療等亟需解決的重要並具挑戰性的科學問題。早先的研究發現一類來自於Listeria monocytogenes前噬菌體的Anti-CRISPR基因AcrIIA4等在細胞內能夠抑制SpyCas9的基因編輯活性，然而這些Anti-CRISPR基因抑制SpyCas9活性的分子機制並不清楚。

為了研究AcrIIA2或AcrIIA4是否能夠直接結合SpyCas9，課題組首先建立體外生物化學研究系統，研究發現Anti-CRISPR蛋白AcrIIA2或AcrIIA4直接結合SpyCas9-sgRNA複合物，有趣的是AcrIIA2或AcrIIA4隻和結合有sgRNA的SpyCas9有相互作用，而和單獨SpyCas9並沒有相互作用；進一步實驗發現AcrIIA2或AcrIIA4能夠直接抑制SpyCas9介導的目的DNA的剪切。

為了研究AcrIIA4直接抑制SpyCas9活性的分子機制，課題組純化出SpyCas9-sgRNA-AcrIIA4複合物，並通過結構生物學研究方法解析了SpyCas9-sgRNA-AcrIIA4複合物的晶體結構，該複合物結構揭示AcrIIA4蛋白構象是一個新的摺疊，它結合在SpyCas9的CTD、TOPO和RuvC三個結構域形成的凹槽區域。該凹槽區域正是SpyCas9上的底物PAM DNA的結合位點；另外來自AcrIIA4的β1摺疊片前的Loop與RuvC活性位點接觸也加強了AcrIIA4對SpyCas9的抑制作用。上述結構觀察結果顯示AcrIIA4和底物PAM DNA競爭性結合SpyCas9，AcrIIA4比底物PAM DNA具有更強的親和力的實驗結果進一步支持了結構觀察的結果。接下來的生化實驗結果進一步證實AcrIIA4結合SpyCas9後抑制底物PAM DNA結合SpyCas9，從而拮抗SpyCas9的活性。

非常顯著的是，AcrIIA4的酸性氨基酸Asp14、Asp37、Glu40、Asp69和 Glu70的位置完全與結合SpyCas9的底物PAM DNA的磷酸主鏈位置一致，而且上述AcrIIA4的氨基酸直接和SpyCas9 PI結構域上的PAM DNA識別氨基酸Glu1108、Ser1109、Ser1216、Lys1200、Arg1335和Arg1333互作。這些結構觀察結果揭示AcrIIA4通過模擬PAM DNA結合SpyCas9。SpyCas9蛋白的AcrIIA4結合氨基酸在同亞型N. meningitidis Cas9 (NmeCas9)中保守，而在不同亞型II-C Listeria monocytogenes Cas9 (LmoCas9)中並不保守，從而很好地解釋了AcrIIA4為什麼能抑制LmoCas9的活性，卻不能抑制NmeCas9的活性。

課題組通過進一步結構比較、分析發現，單獨SpyCas9上並不存在AcrIIA4的結合位點，SpyCas9-sgRNA複合物的形成，使得SpyCas9構象發生顯著變化，組裝形成AcrIIA4結合位點，從而很好地解釋了本項目初始生化研究結果顯示的AcrIIA4隻結合SpyCas9-sgRNA複合物，而不結合單獨SpyCas9。該結果也和細菌細胞內單獨SpyCas9是瞬時存在的，而SpyCas9-sgRNA複合物是主要存在形式相一致。SpyCas9-sgRNA複合物形成時，也是噬菌體被細菌CRISPR免疫系統「發現」並將被「干擾」之時，因此，這個階段（SpyCas9-sgRNA複合物期）是噬菌體抑制細菌的適應性免疫系統（CRISPR-Cas9）的最合適時期。

該研究揭示的Anti-CRISPR 蛋白AcrIIA4抑制SpyCas9活性的分子機制，不僅對揭示細菌免疫系統（CRISPR-Cas9）與噬菌體防禦系統（Anti-CRISPR）「軍備競賽」的共進化分子機制具有重要的科學意義，而且為設計時間、空間特異性地，或條件性地精確控制SpyCas9基因編輯活性的工具提供了結構基礎。該成果是黃志偉團隊繼CRISPR-Cpf1（Nature，2016；RNA Biology，2017）、CRISPR-C2c1(Cell Research，2017)等研究成果之後，在病原與宿主相互作用和基因編輯分子機制研究領域取得的又一重要研究成果。

黃志偉教授為本研究論文的通訊作者，該團隊的博士研究生董德、郭明慧和碩士研究生王思涵3位同學為該論文的並列第一作者。該團隊的師資博士後朱玉威、碩士生王碩、熊智、楊建增、本科生徐增亮參與部分研究工作。全部研究工作在哈工大完成。上海同步輻射中心為晶體數據收集提供了支持。本項目受到國家自然科學基金委、哈工大青年科學家工作室等基金的資助。

Nature文章鏈接：

http://www.nature.com/nature/journal/vaap/ncurrent/full/nature22377.html