上海生科院在視網膜幹細胞胚胎起源研究中取得進展

圖：在斑馬魚出生後18小時到26小時這段期間，視泡中間上皮細胞層的快速分裂的雙潛能細胞（BP，藍色）遷移進入外側上皮細胞層，在這個過程中雙潛能細胞增殖產生一個視網膜色素上皮細胞的前體細胞（PP，黑色）和一個視網膜幹細胞的前體細胞（SP，紅色）。隨後視網膜幹細胞的前體細胞（SP，紅色）表現出較長的細胞周期，並通過細胞分裂產生三種類型的細胞譜系模式：一種為非対稱分裂產生一個視網膜幹細胞（S，紅色）和一個CMZ尖端靜息態細胞（D；黑色/紅色；佔RSC產生的細胞譜系的60%）；第二種為非對稱分裂產生一個視網膜幹細胞RSC（S，紅色）和一個視網膜前體細胞（RP，紅色；佔RSC產生的細胞譜系的38%）；第三種為對稱分裂產生兩個視網膜幹細胞（S，紅色；佔RSC產生的細胞譜系的2%）。與此同時，視網膜色素上皮細胞前體細胞（PP，黑色）通過增殖分裂產生兩種類型的細胞譜系：一種細胞譜系包括兩個視網膜色素細胞（P；黑色，64%）；另外一種細胞譜系包括一個視網膜色素細胞（P，黑色）和一個CMZ尖端靜息態細胞（D，黑色/紅色；36 %）。CMZ尖端靜息態細胞（D，黑色/紅色）既可以由視網膜色素上皮細胞前體細胞（PP, 黑色）產生，也可以由視網膜幹細胞前體細胞（SP，紅色）產生。

5月2日，《細胞生物學雜誌》（Journal of Cell Biology）在線發表了題為《視網膜成體幹細胞胚胎起源雙潛能細胞》的研究論文，該研究由中國科學院上海生命科學研究院神經科學研究所、腦科學與智能技術卓越創新中心何杰研究組完成。該研究採用基於彩虹魚克隆分析，在單細胞水平上揭示了視網膜幹細胞在視網膜睫狀邊緣區的準確定位；同時在邊緣區中發現一類目前尚未報道的靜息態細胞。此外，此研究採用原位細胞譜系追蹤，闡述了視網膜幹細胞胚胎髮育的精確細胞譜系，從而揭示視網膜幹細胞起源於視泡 (optic vesicle)中間層上皮細胞中的一群雙潛能細胞。此項工作發現了視網膜幹細胞發育的細胞譜系基礎，為進一步揭示視網膜幹細胞發育的分子機制，最終實現視網膜幹細胞微環境的體外重建提供重要的實驗依據。

在低等脊椎動物中，視網膜幹細胞位於視網膜睫狀邊緣區中。在低等脊椎動物一生中，例如斑馬魚，視網膜能夠不斷增大。整個終生的視網膜生長就是通過視網膜幹細胞的增殖和分化而實現的。在進化的過程中，更高等的脊椎動物，視網膜睫狀邊緣區細胞產生各種視網膜神經元的能力會更弱。但是越來越多的證據表明，在哺乳動物中，視網膜睫狀邊緣區細胞仍然具備產生新的神經元的潛能，只是在體內環境中，這些潛能被沉默了。其原因目前尚不清晰，這也是神經發育和再生領域一個重大命題。因此，更好地了解低等動物視網膜幹細胞的微環境及其胚胎起源，將更有助於了解高等脊椎動物，如哺乳動物視網膜幹細胞沉默的原因，為尋找激活這些幹細胞的方法提供重要實驗依據。

在以往以斑馬魚為模式動物研究視網膜發育的過程中，發現眼柄通過外翻發育成具有中間上皮細胞和外側上皮細胞的視泡結構，視泡中的中間上皮細胞通過遷移進入外側上皮細胞，逐漸發育為視杯結構，而視網膜的幹細胞就是來源於這群視泡中間上皮細胞。但是對於視網膜幹細胞在視網膜中的具體定位以及胚胎視網膜前體細胞發育為視網膜幹細胞的精確細胞譜系模式尚不清楚。

研究團隊以斑馬魚為模式動物，採用基於彩虹魚的克隆分析，將視網膜幹細胞精確定位於視網膜睫狀邊緣區最外周第二層或第三層細胞。相對於視網膜睫狀邊緣區中其他視網膜前體細胞，視網膜幹細胞的細胞周期比較長。此外，研究團隊還發現視網膜睫狀邊緣區最外周第一層細胞是一類完全處於靜息狀態的新細胞類型。RNA原位雜交實驗表明，它們既不表達視網膜幹細胞的分子標記，也不表達或者僅微弱表達視網膜色素細胞相關的分子標記。關於這類新的細胞對於視網膜幹細胞的維持作用還需要進一步研究。

在準確定位視網膜幹細胞的基礎上，研究人員進一步尋找視網膜幹細胞的胚胎起源。Kaede是一種光轉化蛋白，在405nm激光照射下，能夠由綠色變為紅色。將核定位光轉化蛋白nls-kaede的mRNA注射到野生型斑馬魚的胚胎中。在視網膜發育的視泡階段，對表達Kaede蛋白的視泡中間上皮細胞進行單細胞光轉化，通過分析由單個上皮細胞衍生的克隆，研究人員發現：視網膜幹細胞只能由視泡中間上皮細胞中一群雙潛能細胞產生；這群雙潛能細胞產生視網膜幹細胞的同時產生視網膜色素細胞，是一群細胞周期比較短的細胞。RNA原位雜交實驗表明，這群雙潛能細胞既表達視網膜幹細胞的分子標記，也表達視網膜色素細胞的標記。而視網膜視泡中間上皮細胞中的其他細胞則只能產生視網膜色素細胞或者視網膜前體細胞。

此工作在單細胞水平上揭示了視網膜睫狀邊緣區微環境中的細胞類型組成及其特徵，為深入探究視網膜幹細胞微環境的穩態維持提供了實驗基礎。此外，雙潛能細胞的發現為深入研究視網膜幹細胞胚胎髮育的分子機制提供了細胞譜系基礎，為最終理解視網膜幹細胞的產生和維持機制提供可能。

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