非編碼RNA真的不編碼嗎？9張圖告訴你答案

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近期，Molecular Cell和Cell Research刊登了三篇有關環狀RNA具有翻譯能力的研究，可謂一石激起千層浪，打破了傳統的環狀RNA是非編碼RNA的概念，進一步拓展了環狀RNA的功能，豐富了蛋白質組的組成，意義重大。由此，我們不禁要問，其他的非編碼RNA，特別是長非編碼RNA，擁有與mRNA類似的結構和小的開放閱讀框，是否也具有編碼的能力呢？有趣的是，雖然長非編碼RNA一經鑒定出來就被定義為非編碼RNA，但是關於它們編碼潛能的探索，卻沒有停止。

小編將通過9幅圖，給大家梳理環狀RNA和長非編碼RNA翻譯能力的研究進展。需要注意的是，雖然已有個別非編碼RNA被實驗證明可以翻譯出小肽，有大量非編碼RNA被生物信息學預測可以翻譯出小肽，但也有研究發現，絕大部分非編碼RNA即使結合在核糖體上，也仍然是不翻譯的。這兩個陣營的研究都在9幅圖裡，希望幫大家快速了解有關非編碼RNA的編碼研究。

中國科學院王澤峰研究員在Cell Research上發表題為《Extensive translation of circular RNAs driven by N6-methyladenosine》的研究論文，發現環狀RNA上的甲基化修飾m6A可以驅動非帽依賴性的翻譯機制來合成蛋白質。RNA m6A修飾是近年來RNA表觀遺傳學的研究熱點，越來越多的研究發現m6A與胚胎髮育和疾病，特別是腫瘤，都密切相關。RNA m6A的研究多集中在mRNA上，可影響mRNA的翻譯效率和穩定性，而環狀RNA上的m6A修飾，此前尚屬空白。王澤峰研究員此前已發現在環狀RNA上插入IRES（核糖體進入位點）序列可促進環狀RNA的翻譯，然而在對照序列樣品中，竟然也發現有蛋白的翻譯。通過對這個看似矛盾的現象進行仔細的分析，研究人員發現所有的對照序列竟然都包含m6A修飾位點，這提示m6A修飾可促進環狀RNA的翻譯（圖1）。

研究人員通過分析MeRIP-seq數據，證明內源環狀RNA確實含有m6A修飾，並利用IP，RIP和CLIP-seq等技術，發現m6A的閱讀蛋白YTHDF3可與翻譯起始因子eIF4G2高結合，促進翻譯（圖2）。

以上實驗證明在體外構建含m6A修飾的環狀RNA，導入細胞後可以翻譯，那麼內源的含m6A修飾的環狀RNA是否可以翻譯呢？遺憾的是，研究人員在對蛋白質組的質譜進行分析後，並未找到符合他們預測的環狀RNA編碼的肽段。

如果說找到內源可翻譯的環狀RNA是為它摘掉「非編碼」帽子的鐵證，那麼接下來這兩篇Molecular Cell的文章可以說大大減少了上篇文章的遺憾。

義大利科學家Irene Bozzoni發表《Circ-ZNF609 Is a Circular RNA that Can Be Translated and Functions in Myogenesis》的研究，證明在肌肉發育過程中發揮關鍵作用的環狀RNA Circ-ZNF609，可翻譯小肽。

研究者首先通過RNA測序技術，在人和老鼠的肌肉發育模型中鑒定到一系列差異表達的環狀RNA，通過大規模的功能篩選，最終確定circ-ZNF609在肌肉發育中扮演重要角色。在探究circ-ZNF609促進肌肉發育的分子機制時，研究人員驚喜的發現circ-ZNF609具有開放閱讀框，暗示其具有編碼蛋白的能力。將體外構建的含FLAG標籤的環狀RNA載體導入細胞後，通過western blot的檢測，可以看到在目的位置有明顯的條帶，說明人工構建的帶FLAG標籤的circ-ZNF609是可以翻譯的（圖3）。

那麼，內源的circ-ZNF609同樣可以翻譯嗎？為了解決這個問題，研究者利用CRISPR技術，將FLAG標籤敲入circ-ZNF609的編碼區域以檢測內源蛋白的表達。由於篩選到的單克隆細胞只成功地在一個circ-ZNF609基因座位插入了FLAG標籤，而circ-ZNF609的等位基因則仍是野生型，理論上導致能檢測到的蛋白量減半，所以並未能通過western blot檢測到內源蛋白的表達。研究者將目光轉向蛋白質譜的方法，並在質譜的肽段比對中成功得到了circ-ZNF609的肽段（圖4）。

綜合以上結果，研究者證明了環狀RNA circ-ZNF609具有翻譯的能力，但是關於circ-ZNF609促進肌肉細胞發育的功能，研究者並沒有解釋這是環狀RNA本身的功能，還是其編碼的蛋白的功能。未來還需要更多的研究來探索該類新來源的蛋白的功能及機制。

以色列科學家Sebastian Kadener的文章《Translation of CircRNAs》則是通過生物信息學預測環狀RNA的開放閱讀框，結合核糖體展示技術的數據，分析可與核糖體結合的環狀RNA，從而系統地分析了果蠅中具有編碼潛能的環狀RNA，表明環狀RNA的翻譯能力在進化上可能是保守的，並發現果蠅中大部分可翻譯的環狀RNA與其線性的mRNA共享翻譯起始序列，暗示環狀RNA翻譯的產物與線性mRNA的產物具有類似的5』端結構（圖5）。

以上三篇文章，在人，小鼠和果蠅中鑒定了一批具有翻譯潛能的環狀RNA，那麼同樣是非編碼RNA的長非編碼RNA可以翻譯出蛋白嗎？其實早在2011年，美國科學家Jonathan S. Weissman就通過核糖體展示技術發現有大量的lincRNA結合在核糖體上，表明它們有可能被翻譯（圖6）。黑點表示lincRNA，藍點表示蛋白編碼基因的編碼區（protein-coding），可以看出有很多lincRNA與protein coding有相同的翻譯效率（translational efficiency）。

2016年，Nature上發表John G. Clohessy和 Pier Paolo Pandolfi的研究成果《mTORC1 and muscle regeneration are regulated by the LINC00961-encoded SPAR polypeptide》，發現之前被鑒定為長非編碼RNA的LINC00961有編碼的能力，其編碼的小肽SPAR可抑制mTORC1的活性。值得注意的是，研究人員製備了SPAR的內源抗體，證明該非編碼RNA編碼的小肽確實在體內存在。進一步的實驗證明，如果突變小肽的起始密碼子ATG，可以在不影響LINC00961表達的情況下，使小肽不表達，而這樣的變體是不具備抑制mTORC1活性的功能的。該實驗說明LINC00961以其編碼的小肽發揮功能，而不是RNA本身（圖7）。

看到這，大家是不是已經躍躍欲試了呢？小編要啰嗦幾句，關於非編碼RNA可編碼的研究，還需大膽假設，小心求證。

2012年，nature chemical biology發表John L rinn和alan saghatelian的論文《peptidomic discovery of short open reading frame–encoded peptides in human cells》。該研究通過對蛋白質譜的分析，鑒定了新的小肽，並利用肽段序列比對回基因組來確定產生的新的小肽的基因。他們發現只有極少數的小肽來源於ncRNA，說明大部分ncRNA是不翻譯的（圖8）。

而2013年Cell上的文章，則更加直白，Eric S. Lander發表題為《Ribosome Profiling Provides Evidence that Large Noncoding RNAs Do Not Encode Proteins》，該研究認為，現在大部分關於非編碼RNA可編碼的研究都基於對核糖體展示技術的數據分析，不可否認，確實有很多非編碼RNA結合在核糖體上，但這並不意味著它們被翻譯了。得出這樣驚人的結論，主要是基於核糖體在mRNA的結合是一個動態過程（圖9.1）。40S的核糖體小亞基首先結合在5』UTR區，識別到起始密碼子的時候，60S的核糖體大亞基才會與小亞基結合，形成80S的複合體。這樣的翻譯複合體在遇到終止密碼時會分離開，所以理論上3』UTR是不應該存在核糖體結合的。傳統的RNA翻譯效率的計算，只考慮了RNA在核糖體上結合的數量，而沒有考慮核糖體在RNA的非翻譯區的釋放過程，所以研究者重新定義了翻譯效率的計算公式（圖9.2），只有當核糖體在同一條RNA的翻譯區（ORF）結合量明顯高於非翻譯區的結合量，才認為該RNA是被翻譯的。經過這樣的計算，大部分的lincRNA與mRNA的翻譯區都區別開了（圖9.3）

通過以上9幅圖的梳理，我們可以看出，有關非編碼RNA可編碼的研究，一直非編碼RNA領域的熱點和難點，雖然個別環狀RNA和長非編碼RNA產生的小肽被證明有功能，但是大部分的研究多還集中在鑒定和預測上。如果想要在該領域取得突破的成績，並不輕鬆，難點在與如何證明非編碼RNA產生的小肽是內源的以及他們的功能機制又是什麼。未來期待有更多的研究和方法，打開非編碼RNA的編碼大門！

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