微生物所在CRISPR適應機制方面取得系列進展

引發適應過程中 spacer 的尋取和定點整合機制示意圖

CRISPRs-Cas 系統是廣泛存在於細菌和古菌中的適應性核酸免疫系統。該系統具有豐富多樣的功能組分和核酸處理機制，為人類提供了迄今最高效的基因組編輯技術（如 CRISPR-Cas9 系統）和基因檢測技術（如 CRISPR-C2c2/Cas13a 系統），同時也為理解生命的進化與適應機制提供了前沿窗口。中國科學院微生物研究所微生物資源前期開發國家重點實驗室向華研究組是我國較早從事 CRISPR-Cas 系統基礎研究的團隊，面對國際上長期缺乏 CRISPR 從純病毒高效獲取 spacer 的適應系統的困境，於 2014 年在古菌中建立了首個（所有系統中第二個）CRISPR-Cas 系統對純病毒的高效適應體系，揭示了嗜鹽古菌 I - B 型 CRISPR 高效適應需要「引發」的本質，首次提出了引發適應可能是 CRISPR 系統在自然界對病毒發生高效適應的主要模式這一重要論斷；並進一步發現除高效性外，引發適應還通過巧妙的 PAM 驗證實現了嚴格的異己區分和高效的防病毒逃逸機制，回答了困擾科學家多年的 CRISPR 適應過程的高效性及異己區分難題（Nucleic Acids Res., 2014，42：2483–2492；Nucleic Acids Res., 2014，42：7226–7235）。相關工作作為 CRISPR 適應領域的重要發現已被 Nature, Cell,Science, PNAS 等引用 80 余次。最近，向華研究組通過對該 CRISPR 系統的人工改建，又在 CRISPR 適應過程中 spacer 的長度決定和定點整合的位點識別機制方面連續取得了新的進展（Nucleic Acids Res., 2016，44：4266–4277；Nucleic Acids Res., 2017，45 : 4642-4654）。

CRISPR 適應過程中，spacer 整合反應往往發生於 CRISPR 結構的 leader 端且與其緊鄰的 repeat 將發生精確複製。長期以來，國際上普遍認為整合複合物先識別 repeat 的一端，再通過嚴格的分子尺機制識別另一端，從而確定新複製 repeat 的尺寸和序列。但有意思的是，多個研究團隊傾向於先識別序列保守的「repeat 近 leader」端，而另外有實驗室則認為是先識別「repeat 遠 leader」端。向華研究組巧妙設計了一個引發 - 整合相分離的 CRISPR 高效適應系統，通過系統的掃描突變鑒定了 repeat 內部兩個關鍵的整合識別元件。其中，元件 1（AACCC）嚴格位於「近 leader」端整合位點的下游 10 bp 處，而「遠 leader」端整合反應嚴格地發生於元件 2（GTGGG）下游約 10 bp 處。上述兩元件為 repeat 識別所必需，且其間距的增減可在一定範圍內相應增減 repeat 的固有尺寸，這說明在 spacer 整合過程中並不存在 repeat 長度的分子尺機制，而是整合複合物先識別近 leader 的 repeat 的內部關鍵元件，並通過 10-bp 左右的分子尺識別兩端的整合反應位點（Nucleic Acids Res., 2016，44：4266–4277）。有意思的是，這一重要發現發表不久，很快得到了國際上其他團隊在大腸桿菌中實驗數據的支持，說明了該機制在不同 CRISPR 系統中具有普遍性。

關於 spacer 長度決定機制，2016 年國際上兩家重要實驗室幾乎同時解析了大腸桿菌 spacer 獲取機器（Cas1-Cas2 複合物）在底物結合狀態下的晶體結構，他們發現該複合物的結構性限制提供了一個固定的分子尺，並界定了 spacer 的長度。但令人費解的是，在其它大多數的 CRISPR 系統中，spacer 長度並非固定不變，而是具有一定的尺寸多態性。向華研究組進一步設計了一個 CRISPR 單一引發的適應系統，利用高通量測序技術，分析了近 4 萬個新 spacer 的獲取過程，發現與自然界已有的數據一樣，這些 spacer 的尺寸並非固定不變，而是在一定範圍內呈現正態分布。有意思的是，他們通過生物信息學分析檢測到在 spacer 倒數第三個鹼基位點上的胞嘧啶（C）偏好性，對相應位點的突變則可改變獲取 spacer 的尺寸。該高通量數據結合分子遺傳學實驗分析，首次發現 spacer 獲取機器不僅識別 protospacer 5』一側的 PAM 序列，而且識別 protospacer 3』端的部分序列，這一序列特異性識別可對獲取機器的分子尺機制進行微調，從而導致了 spacer 尺寸的多態性。該 spacer 獲取的大數據分析工作，還觀測到了適應機器在病毒模板上的滑脫（slip）和在整合過程中的翻轉（flip）現象，並進一步證明了引發適應過程中雙向尋取 spacer 的滑動（sliding）假說（Nucleic Acids Res., 2017，45 : 4642-4654）。

上述最新進展為系統理解 CRISPR 引發適應過程（靶向引發，雙向尋取，定點整合）的高效性與特異性提供了新的依據（圖 1），也為未來開發基於 CRISPR 精妙的適應過程的分子生物學技術奠定了基礎。向華團隊的李明和龔路遙是 Nucleic Acids Res., 2017，45 : 4642-4654 的並列第一作者；王銳和李明是 Nucleic Acids Res., 2016，44: 4266–4277 的並列第一作者；向華是上述論文的唯一通訊作者。相關研究得到了國家自然科學基金（面上項目）的資助。

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