Cell：中國學者首次建立基因編輯瑞特綜合征猴模型

2017年5月18日，季維智、陳永昌研究團隊和同濟大學醫學院孫毅在Cell雜誌發表新成果。

導語：

瑞特綜合征（Rett syndrome）屬於自閉症譜系範疇的神經發育性疾病，超過95%的瑞特綜合征患兒攜帶MECP2基因突變。2017年5月18日，來自昆明理工大學、雲南省靈長類生物醫學重點實驗室季維智、陳永昌研究團隊和同濟大學醫學院孫毅團隊在Cell雜誌發表了題為「Modeling Rett Syndrome Using TALEN-Edited MECP2 Mutant Cynomolgus Monkeys」的研究論文。運用TALEN技術開展食蟹猴瑞特綜合征模型的研究，論文首次建立基於基因編輯的非人靈長類疾病模型，同時成功地利用基因編輯非人靈長類模型，從行為模式、病理髮生及其機制開展的系統性研究工作，對未來更深入地開展瑞特綜合徵發病機理研究和探索臨床有效干預方法將產生深刻影響。本文作者中科院神經所研究員仇子龍從瑞特綜合征的由來寫起，再到對季維智、孫毅等老師在這一領域的工作以及本次研究的評述，其中穿插個人與幾位研究者的交集以及對這一領域的理解，娓娓道來。

撰文丨仇子龍 （中科院上海神經科學研究所研究員、國家「傑青」）

2006年春天，美國加州南部小鎮，一個安靜的美國家庭中突然來了很多客人，有加州大學洛杉磯分校（UCLA）和聖迭戈分校（UCSD）的教授們，也有許多坐著輪椅的女孩。這些女孩坐在輪椅上，目光中透露出對世界的好奇，但是卻無法言語，手足間常常有不自主的顫動。女孩們有一個共同的特徵，這就是她們體內的MECP2基因都發生了嚴重的突變，導致她們患有瑞特綜合征（Rett syndrome）。

十年前，在這次由瑞特綜合征家長與瑞特綜合征研究基金會組織的病人與科學家見面會上，還在加州大學聖迭戈分校（UCSD）做博士後研究的我，第一次遇到了仰慕已久的加州大學洛杉磯分校的孫毅教授。

瑞特綜合征是一種嚴重的神經發育性疾病，時至今日仍然沒有有效的治療方法，在20世紀60年代由Andreas Rett醫生首先予以定義。1999年，美國貝勒醫學院的Huda Zoghbi教授經過艱苦的努力，尋找到了導致瑞特綜合征的「罪魁禍首」——MECP2基因，研究者發現95%的瑞特綜合征女孩都攜帶MECP2基因的突變。關於MECP2與瑞特綜合征的歷史，請看筆者的另一篇文章（1）。瑞特綜合征因為患者具有手部的刻板行為，早年被神經科醫生歸為自閉症譜系障礙（Autism spectrum disorder）。MECP2基因後來被發現基因的倍增會在男孩中導致嚴重自閉症，因此它與自閉症的關係始終非常密切，對MECP2基因的研究也為我們認識了解自閉症打開了一扇重要的窗戶。

當時在UCLA的孫毅教授是MECP2研究領域的開闢者之一，2003年她與哈佛大學Mike Greenberg教授同時在Science雜誌上發表文章，報道MECP2在神經元中調控基因表達的新機理（2, 3）。孫毅教授後來在MECP2基因領域又有一系列出色的工作發表。於2006年獲得了瑞特綜合征研究基金會博後基金的我也正式開始了MECP2的研究工作。

與這次基金會組織的病人、科學家見面會一樣，對於瑞特綜合征的研究工作始終與病人無法分開。組織這次見面會的Monica就是一位瑞特綜合征女孩的媽媽，為了早日治癒她們的女兒，美國的一些瑞特綜合征家長組織起來成立了私人基金會，募集捐款，支持瑞特綜合征與MECP2相關的科學研究工作，她們深深了解科學在疾病治療過程中的巨大作用（見下圖）。在對MECP2進行了漫長的科學研究後，我們對這個基因及其編碼蛋白的功能有了非常深入的了解，比如表觀遺傳學調控，小RNA剪切加工以及調控突觸可塑性等等。但病人家長和科學家們都迫切地想知道，基礎科學研究最終距離幫助這些瑞特綜合征孩子們究竟還有多遠？

Monica Coenraads和她的女兒Chelsea.HHMI Bulletin，2006

人類的大腦非常複雜，具有複雜的溝回以及大腦分區，作為我們最常用的實驗模式動物———小鼠來說，其大腦的結構雖然具有對應的感覺與運動皮層等基本結構——「麻雀雖小，五臟俱全」(見下圖)，但是對於瑞特綜合征這種複雜的腦疾病來說，與瑞特綜合征女孩一樣缺失了MECP2基因的小鼠，卻不能完整模擬人類病患的臨床病理特徵 (4)。例如MECP2缺失的男孩無法出生，而缺失MECP2基因的雄性小鼠卻能活至近成年期，攜帶MECP2基因突變的雌性小鼠也通常能夠正常生育，直到6-9月後才會發病。是否有可能在儘可能接近人類的動物模型中建立瑞特綜合征的模型，從而加快應對藥物的研發工作呢？

動物大腦比較左上角人類大腦，右下角實驗小鼠大腦，（DeFelipe 2011）

2009年，孫毅教授回國擔任上海同濟大學醫學院幹細胞研究中心主任、千人計劃專家，2012年，她開始與雲南中科靈長類生物醫學重點實驗室、昆明理工大學季維智教授一起，探討應用非人靈長類——猴類來建立瑞特綜合征模型的可能性。2009年，我也從UCSD回到中科院上海神經所，建立了自己的實驗室，開展了獨立的MECP2研究工作。

是否有可能在猴類中敲除MECP2基因？季維智教授長期從事獼猴胚胎幹細胞及基因修飾構建靈長類動物模型的工作，但是當時的獼猴胚胎幹細胞還不能像小鼠胚胎幹細胞一樣發育成子代個體。從2010年開始，基因編輯方法的出現讓這一切成為可能，第一個出現的基因編輯工具為鋅指核酸酶（zinc finger nuclease），雖然可以對基因組中的基因進行定點切割，但是效率不盡人意；第二類基因編輯工具TALEN（Transcription activator-like effector nucleases）的出現，讓在細胞系中準確進行基因操作以及製作基因編輯動物的出現成為了可能。當然於2013年1月被首次在哺乳類細胞中進行基因編輯而被報道的第三類基因編輯工具CRISPR/Cas9 (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)已經成為傳奇，是目前最好的基因編輯工具。

2012年，當TALEN方法被證明可以在小鼠受精卵中成功敲除目標基因的時候，季維智教授、孫毅教授和在中科院神經所的我都意識到千載難逢的機會就在眼前。如果TALEN的效率足夠高，直接將TALEN mRNA注射入獼猴受精卵，那麼獼猴的MECP2基因就有可能被直接敲除！ 2012年底，季維智、孫毅教授團隊和我們不約而同地開始了在猴類中進行TALEN方法的基因打靶工作。2013年下半年，經過食蟹猴漫長的近六個月懷孕期，第一批註射了打靶MECP2基因的TALEN mRNA的食蟹猴出生了（5, 6）。2013年，第三代基因編輯工具CRISPR/Cas9也出現了，季維智教授與沙家豪教授、黃行許教授開展合作，運用CRISPR/Cas9方法建立的基因突變猴也於2013年底出生了（7）。這三個工作發表於2014年上半年，宣告人類在靈長類動物中進行基因操控時代的到來（下圖）。

然而基因操控還只是第一步，基因突變猴是否能更好地模擬人類的瑞特綜合征女孩呢？季維智與孫毅教授的工作得到了數只攜帶MECP2基因突變的雌性食蟹猴，而我們只得到了一隻攜帶MECP2基因缺失的雄性食蟹猴，出生不久便去世，因此我們將工作集中到了MECP2轉基因猴上，於2016年2月發表了MECP2轉基因猴模擬MECP2倍增綜合征病人自閉症樣癥狀的文章（8）（下圖）。

2016年，仇子龍轉基因猴成果發表在Nature上

從2014年起，季維智教授與孫毅教授一起對MECP2基因突變猴開展了細緻的功能研究，經過漫長的雜誌評審過程，此工作終於於2017年5月18日在線發表在國際頂級生物學期刊Cell上（9）。在此項工作中，他們首先對基因突變猴進行了嚴格的基因測序及表達蛋白分析，證明了這些基因突變猴儘管還是基因突變的嵌合體，但是體內的MECP2蛋白明顯表達下降，可以作為基因突變的模型進行研究。

研究者接著與中科院自動化所蔣田仔研究員合作，運用核磁共振成像的方法研究了基因突變猴大腦的結構，他們的結果顯示基因突變猴在多個腦區包括杏仁核與cingulate cortex等等出現結構向的減小（下圖）。對猴類的大腦還可以做多種功能的腦成像，例如彌散張量成像（DTI）等。此類腦成像實驗無法對小鼠模型進行研究，因為小鼠大腦結果相比之下太簡單，不具有如此複雜的結構。

基因突變猴在多個腦區包括杏仁核與cingulate cortex等等出現結構向的減小

季維智教授與孫毅教授接下來與中科院昆明動物所胡新天研究員等進行合作，對MECP2基因突變猴開展了一系列針對瑞特綜合征與自閉症譜系障礙的行為學檢測。首先，他們發現在MECP2突變猴表現出睡眠障礙，出現更碎片化的睡眠狀況。在瑞特綜合征中睡眠障礙問題是非常突出的臨床癥狀之一。其次，研究團隊發現MECP2突變猴出現了一系列自閉症樣癥狀，如主動社交接觸變少、刻板樣行為變多等。這些自閉症樣行為在MECP2轉基因猴中也有報道（8）。季維智教授與孫毅教授的團隊更進一步，對MECP2基因突變猴進行了一個更令人信服的實驗。我們知道自閉症孩子通常不與別人目光對視，心理物理學家後來發現，如果對自閉症孩子進行嚴格的眼動跟蹤實驗，自閉症孩子通常對人臉或者有感情的人臉無動於衷。研究者對MECP2基因突變猴也開展了這個實驗，這個實驗需要對基因突變猴及野生對照猴進行長達數月的訓練，才能讓猴子安靜的在椅子上坐著進行認知實驗。研究者發現，MECP2基因突變猴明顯降低了對有表情的猴臉的興趣，對明顯更有攻擊性和屈服的猴臉表示沒有興趣，而對面無表情的猴臉予以更多的關注（見下圖）。這個實驗進一步令人信服地表明，猴類做為腦疾病的模型有小鼠模型無法比擬的優勢。

基因突變猴及野生猴對照實驗

經過這些研究，季維智教授與孫毅教授首次對經過基因編輯的MECP2突變猴進行了詳盡的生理學與行為學研究，為在基因突變猴中，開展下一階段的藥物篩選實驗打下了堅實的基礎。此工作也再一次證明了獼猴作為腦疾病的動物模型，比小鼠模型具有更大的優勢。

隨著國內遺傳病基因檢測水平的進步，國內的醫院也陸續發現了很多罹患瑞特綜合征的孩子們。對瑞特綜合征這一腦疾病的攻堅戰已經打響，對瑞特綜合征的研究與臨床干預的嘗試，也會將對自閉症譜系障礙的研究起到極大的推動作用。讓我們共同期待科學家與醫生攜手攻克瑞特綜合征這一天的到來！

註：本文首發於微信公號：Bioart，《知識分子》獲作者授權刊發。

參考文獻

1. 逆轉基因決定的命運：自閉症研究或現曙光 知識分子公眾號 2016年6月2日，原載於《生命的化學》

2. Chen et al. Derepression of BDNF transcription involves calcium-dependent phosphorylation of MeCP2. Science. 2003 Oct 31;302(5646):885-9.

3. Martinowich et al. DNA methylation-related chromatin remodeling in activity-dependent BDNF gene regulation.Science. 2003 Oct 31;302(5646):890-3.z

4. Guy et al. A mouse Mecp2-null mutation causes neurological symptoms that mimic Rett syndrome. Nat Genet. 2001 Mar;27(3):322-6.

5. Liu et al. TALEN-mediated gene mutagenesis in rhesus and cynomolgus monkeys. Cell Stem Cell. 2014 Mar 6;14(3):323-8

6. Liu et al. Generation of a monkey with MECP2 mutations by TALEN-based gene targeting. Neurosci Bull. 2014 Jun;30(3):381-6

7. Niu et al. Generation of gene-modified cynomolgus monkey via Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos. Cell. 2014 Feb 13;156(4):836-43

8. Liu et al. Autism-like behaviours and germline transmission in transgenic monkeys overexpressing MeCP2. Nature. 2016 Feb 4;530(7588):98-102

9. Chen et al. Modeling Rett syndrome using TALEN-edited MECP2 mutant cynomolgus monkey. Cell (2017) 169,1-11. http://dx.doi.org/ 10.1016/j.cell.2017.04.035

研究者簡介

季維智/ 昆明理工大學特聘教授

長期從事靈長類生殖生物學研究，研究重點為胚胎早期發育調控，幹細胞生物學和疾病模型。其所領導的研究團隊在獼猴幹細胞和轉基因靈長類動物方面獲得國際一流的研究成果，使我國在非人靈長類靶向基因修飾的研究，居於世界領先水平。在Cell，Cell Stem Cell, PNAS, Stem Cells，JBC，Biology of Reproduction， Human Reproduction等雜誌上發表論文100餘篇。現任昆明理工大學特聘教授，靈長類轉化醫學研究院院長，雲南省靈長類生物醫學動物重點實驗室理事長，生物醫學動物模型國家地方聯合工程研究中心主任。「世界經濟論壇全球未來理事會」理事，「國家幹細胞研究指導協調委員會」專家，「國家重大科學研究計劃生殖與發育專家組」成員(2006-2014)， 「國家實驗動物研究委員會」專家組成員和973項目首席科學家。長期從事靈長類生殖生物學研究。

孫毅/同濟大學醫學院教授，國家「千人計劃」專家

1987年於復旦大學畢業獲得學士學位，後就讀於美國凱斯西儲大學神經生物學專業，並於1996年獲得博士學位。後在哈佛大學神經發育生物學系從事博士後研究工作。長期致力於神經系統發育和疾病的表觀遺傳學及分子機制研究。在神經發育方面主要貢獻在於闡明了神經幹細胞或祖細胞在往神經元或膠質細胞分化過程中命運決定的分子機制， 包括首次發現LIF激動的JAK-STAT pathway 是星形膠質細胞命運決定的主要通路(Science, 1997)， 首次闡明決定神經元命運的pro-neural bHLH 因子和JAK-STAT pathway 之間的相互抑制作用(Cell, 2001)。於2001年孫毅教授在美國加州大學(UCLA)建立實驗室後潛心研究DNA甲基化，組蛋白修飾，及非編碼RNA在神經系統發育，包括細胞命運決定，神經元功能成熟，及其可塑性變化過程中的作用。在神經疾病研究方面，她的實驗室是最早開始用人類ES細胞iPS細胞做神經系統疾病模型的實驗室之一， 並取得了突破性成果。2009年回國後，開始進行大量轉化醫學研究主要在幹細胞治療脊髓損傷方面開始了一系列原創性的研究。另外在用幹細胞建立孤獨症模型方面已取得突破性成果。她帶領的團隊在同濟大學原創性地研發了體細胞單細胞全基因組轉錄本的RNA深度測序方法並用於研究成體神經幹細胞的分子生物學性狀，探討成體幹細胞及腫瘤幹細胞靜息活化過程中的機制，該技術對未來尋找各類疾病包括衰老的分子標記會有劃時代的推動。孫毅教授近年來以通訊作者身份在Science, Cell, Cell Stem Cell, Nature Neuroscience, Neuron, PNAS等雜誌上發表多篇論文。

陳永昌 / 昆明理工大學靈長類轉化醫學研究院教授

2010年獲得中國科學院昆明動物研究所博士學位；2003-2014年，擔任中國科學院昆明動物研究所副研究員；2012年-至今，擔任雲南中科靈長類生物醫學重點實驗室研究員，昆明理工大學靈長類轉化醫學研究院教授。主要研究方向：基因修飾技術構建人類重大疾病的靈長類動物模型。目前已建立了多種神經系統疾病的靈長類動物模型，包括帕金森病（Parkinson s Disease）、肌萎縮側索硬化症（Amyotrophic Lateral Sclerosis，ALS）、杜氏肌營養不良症（Duchenne Muscular Dystrophy，DMD）及瑞特綜合征（Rett Syndrome，RTT）的基因編輯猴模型。近年來以第一作者或通訊作者身份在包括Cell、Cell Stem Cell、Cell Research、Human Molecular Genetics等雜誌上發表多篇研究成果。

製版編輯：葉水送丨

本頁刊發內容未經書面許可禁止轉載及使用

公眾號、報刊等轉載請聯繫授權

喜歡這篇文章嗎？立刻分享出去讓更多人知道吧！