失眠？可能是這些細胞不配合！科學家用病毒示蹤和RNA測序精確定義了睡眠神經元

導讀：與睡眠相關的神經元如何被發現？怎麼進行研究？來看看UC Berkeley丹揚教授的最新大作，利用病毒神經環路示蹤和基因表達譜發現並定義了睡眠神經元。

睡眠一直以來是人們比較感興趣的研究課題，因為人的一生大約有1/3的時間是在睡眠中度過的。睡眠是每個人生命中的必需品，但它也困擾了很多人的日常生活。

近幾十年，隨著腦電記錄技術的發展，人們發現睡眠過程並不是一成不變的。從腦電的檢查結果來看，正常人在睡眠時，存在兩種截然不同的現象：有時眼球快速來回活動，被稱作快速眼動期睡眠（REM），有時眼球不活動或者只有很慢的浮動，被稱作非快速眼動期睡眠（NREM），同時腦電活動也出現了不同的變化。

雖然，我們對睡眠的不同階段有了一些了解，但是對睡眠的腦機制尚不清楚。當前研究發現表明，如果腦中的下丘腦視前區（Preoptic area, POA）發生了損傷，會導致嚴重的睡眠障礙，這說明視前區在睡眠的產生中起到重要的作用。然而，到底是哪些神經環路促進了睡眠很不清楚，尤其是睡眠神經元和清醒相關神經元在空間上並沒有明顯區分，這給人們研究特定的睡眠神經環路製造了難度。

這種情況下，鑒定和發現特定的睡眠相關神經元顯得尤為重要。最近，Nature發表了UC Berkeley的丹揚教授最新發現。他們基於投射通路分離了一類POA睡眠神經元，並鑒定了這類細胞的特定分子標記[1]。

研究思路和結果

1.利用c-Fos檢測找到睡眠相關的神經元

要詳細分析睡眠的神經環路，我們首先得找到與睡眠相關的神經環路。文中，作者首先在動物睡眠和清醒狀態下，檢測POA神經元c-Fos表達量（表徵神經元的活動）。通過c-Fos與逆標染料的結果，作者發現POA投射到TMN（組胺能結節乳頭核）的神經環路與睡眠相關（圖1a）；而且， GABA能的中間神經元在此過程中更重要（圖1b）。因此，後面的實驗圍繞這條GABA能神經元介導的POA-TMN神經通路（GABAPOATMN）展開。

圖1 GABAPOATMN神經元參與睡眠

2.光遺傳技術操控特定神經環路，研究睡眠行為的變化

作者接下來在GAD2-Cre小鼠（GABA能神經元特異表達Cre）TMN腦區注射能夠逆向標記的病毒rEIAV，在GABAPOATMN神經元表達ChR2（照光興奮）或iC++通道（照光抑制）。隨後，作者通過電生理記錄檢測動物的睡眠狀態（即REMNREMWake狀態），並利用激光激活或抑制GABAPOATMN，發現睡眠行為分別發生了增強或減弱（圖2）。

（小編感想，和元的rAAV2-retro病毒做這個逆向標記實驗可能更好哦！）

圖2 光遺傳技術操控GABAPOATMN神經元改變睡眠

3.光遺傳激活POA的GABA能神經元會增強覺醒

圖3 激活POA腦區GABA能神經元或谷氨酸能神經元促進覺醒

4.光電極記錄鑒定睡眠相關的GABAPOATMN

上述「矛盾」是怎麼回事？作者接下來通過光電極記錄手段（光纖+多通道記錄），鑒定了一些能夠被激光激活的POA區GABA能中間神經元（GABAPOATMN），結果發現這些神經元在睡眠中大量活動（圖4），這進一步說明GABAPOATMN與睡眠密切相關。

圖4 POA-TMN的GABA能神經元在睡眠時活動

5.通過RNA測序發現睡眠神經元的標誌物

然而，僅僅知道睡眠時活動的神經元是遠遠不夠的，我們還想知道哪些神經元具有促進睡眠的功能？

因而，作者最後使用單細胞RNA測序和翻譯核糖體親和純化（translating ribosome affinity purification，TRAP）技術鑒定了GABAPOATMN神經元的標記物。通過大量篩選，他們發現腸促胰酶肽（CCK）、促腎上腺皮質激素釋放激素（CRH）以及速激肽1（TAC-1）能夠特徵性標記促進睡眠的神經元（圖5）。

圖5 POA睡眠神經元的新分子標記

總結

丹揚教授的研究使用病毒逆向追蹤的手段鑒定了睡眠相關的GABAPOATMN通路，同時結合RNA測序技術找到了促進睡眠的視前區神經元標記物。這項工作除了為我們提供了研究功能相關神經元的範例，還為未來的研究提供了標記促睡眠神經元的工具。

參考文獻

1.Chung S, Weber F, Zhong P, Tan CL, Nguyen TN, Beier KT, et al. Identification of preoptic sleep neurons using retrograde labelling and gene profiling. Nature. 2017.

喜歡這篇文章嗎？立刻分享出去讓更多人知道吧！