你都知道？非編碼RNA研究技術大盤點

最新 05-25

非編碼RNA可火了，miRNA大火燒了十幾年，現在慢慢地把lncRNA的領域也給點著了。現在可能連實驗室的插槍頭阿姨都知道絕大多數的RNA分子並不翻譯，這非編碼RNA(noncoding RNA)，包括miRNA、lncRNA等。

目前主要研究方向集中在非編碼RNA 及其相互結合的DNA、RNA、蛋白質等科學問題，而科學問題的解答依賴於實驗技術的創新使用和革命。

ncRNA可以海陸空全面調控細胞功能，厲害了，其實主要指lncRNA，而miRNA、siRNA主要作用於mRNA層面，本文按非編碼RNA的三個調控維度，就當前主要的實驗技術簡單介紹一下。

(一) DNA維度

1）作用的ncRNA類型：lncRNA等

2）研究方法介紹有：

和DNA序列結合的調控目的無非是阻止下游基因的轉錄把轉錄因子、甲基化酶等招惹過來修飾DNA序列。他們的共同特點是和解鏈的DNA的某一條鏈結合，那麼研究方法包括

1. RNA原位雜交(RNAin situ hybridization)

檢測該ncRNA是否位於核內，如果不在核內，那就不用考慮和DNA作用了。

RNA原位雜交是指將特定標記的已知順序核酸為探針與細胞或組織切片中核酸進行雜交，從而對特定核酸順序進行精確定量定位的過程。原位雜交可以在細胞標本或組織標本上進行。根據RNA序列設計cDNA、cRNA探針，對目標進行定位。

2. ChIRP(chromatin isolation by RNA purifications)

是一項通過純化RNA 分子從而獲得其結合的染色質片段( 包括RNA 結合蛋白與基因組DNA) 的實驗方法。

大概流程：首先細胞交聯，使lncRNA、染色質及被固定連接；隨後通過超聲將染色質打斷，並使用帶有生物素標記的tiling oligos與長鏈非編碼RNA 分子雜交；之後利用親和素磁珠純化長鏈非編碼RNA 及其結合的染色質片段；後續分析和測序

3. ncRNA-DNA三聯體的體外同位素檢測

為了進一步檢驗這種調控機制和結合方式，可以在體外分別合成此ncRNA和DNA片段，並用同位素（P32）標記，在體外做結合實驗，如果不結合，那麼就會呈現兩條已知的條帶，如果能夠結合，那麼就會有一條RNA-DNA分子量新條帶出現。

（二）RNA維度

1）作用的ncRNA類型：mRNA-miRNA-lncRNA+circRNA等

2）研究方法

既然是RNA-RNA相互作用，除了胞內FISH定位技術以外，還有其他技術要使用，如下

1.CLASH (crosslinking-ligation and sequencing ofhybrids)

對RNA 分子與RNA 分子相互作用進行研究的實驗系統，主要被用於鑒定miRNA 與其靶mRNA 的相互作用。大概流程為：首先對細胞進行交聯處理，將miRNA 及其靶mRNA 與RISC 複合物固定連接；隨後通過Co-IP富集純化RISC 複合物；之後再通過分子內連接將miRNA 的3 -OH 末端與靶mRNA 的5 -PO4 末端連接，形成一條長的單鏈RNA，然後測序。

2.CHART(CaptureHybridization Analysis of RNA Targets)

也可以叫做RNA precipitation，根據ncRNA序列設計探針，二次探針交聯在固相載體上，若將核內RNA-DNA狀態固定處理，染色質超聲打碎成小片段，RNA-DNA的結構就可以被探針抓取下來，利用DNA-Seq對抓取的DNA進行測序，獲得DNA結合序列的信息（不過這個可以被生信分析工具所預測一下）。

3.熒光素酶報告系統

在熒光素酶報告基因載體的報告基因編碼區的下游插入ncRNA結合序列或者mRNA的3』 UTR區，然後將構建好的載體轉染細胞並改變細胞中相應miRNA的表達水平，通過檢測熒光素酶的表達情況以分析ncRNA或者mRNA的3』 UTR區中是否含有miRNA的靶位點。同理任意兩種RNA-RNA互作都可以利用這個原理。