CHD4-癌症不滅原因

Cancer cellhttp://www.cell.com/cancer-cell/pdf/S1535-6108(17)30160-5.pdfCHD4 Has Oncogenic Functions in Initiatingand Maintaining Epigenetic Suppression of Multiple Tumor Suppressor Genes標題：染色質螺旋酶DNA結合蛋白4（CHD4）初始並維持表觀的抑制多個腫瘤抑制基因而具有致癌功能要點：CHD4促進DNA超甲基化CHD4敲除重激活超甲基化的基因抑制CHD4降低腫瘤生成腫瘤內高水平的CHD4顯示更差的預後

摘要：CHD4，一個NuRD組件, 在人類大腸癌其致癌作用被定義為初始並支持腫瘤抑制基因(TSG)靜默。CHD4招募抑制染色質蛋白到DNA損傷修復處,包括DNA甲基轉移酶，強制重新開始DNA甲基化。對腫瘤抑制基因來說,CHD4滯留幫助維持DNA超甲基化相關的轉錄靜默。CHD4被切除修復蛋白質OGG1招募與損害誘導基8-羥基脫氧鳥苷 (8-OHdG)相互作用應對氧化損傷,而ZMYND8招募CHD4應對雙鏈斷裂。CHD4敲除激活沉默腫瘤抑制基因,削弱大腸癌細胞增殖,侵犯和轉移。高CHD4和8-OHdG水平+低表達的腫瘤抑制基因與早期大腸癌複發和總體存活率下降高度相關。

本文意義：

CHD4,一個核小體重建模和組蛋白去乙醯化NuRD複合體關鍵組件, 與雙鏈斷裂DNA損傷修復期間調節轉錄抑制有關。CHD4被招募到與氧化損傷有關的單鏈斷裂修復。 在這些位點， 對招募DNA甲基化轉移酶，CHD4起上游信號作用。甲基化轉移酶是一個關鍵的轉錄抑制蛋白，初始異常DNA重新甲基化。CHD4滯留在異常DNA損傷部位超甲基化啟動子區CpG島能夠維持腫瘤抑制基因靜默。這些活性確定CHD4的致癌作用, 顯示了對大腸癌重要的生物學和轉錄意義。

結果：

在氧化損傷期間CHD4去誘導招募DNA甲基化轉移酶DNMT1,DNMT3A,DNMT3B到核染色質。

在互惠內生的免疫沉澱反應中使用大腸癌和胚胎癌細胞， 經過過氧化氫(H22)誘導的氧化損傷後，CHD4與 DNMT1, DNMT3A, DNMT3B相互作用並伴隨強度增加。牢固結合染色質也在CHD4,DNMT1, DNMT3A， DNMT3B出現後，但不改變總細胞水平。在H22治療後敲除CHD4明顯降低每個蛋白的結合牢固性，但是敲除大腸癌細胞DNMT3A, DNMT3B,或嚴重基因破壞DNMT1(DNMT1亞等位基因)也不會出現明顯降低每個蛋白的牢固性。因此，氧化損傷誘導增加DNMT1 ,DNMT3A,DNMT3B 到染色質的親和力與CHD4有關.CHD4對招募 DNMT1， DNMT3A,DNMT3B是必須的, 因其一開始對DNA單鏈或雙鏈斷裂進行甲基化。

HCT116細胞系，激光輻射1分鐘誘導單鏈斷裂和雙鏈斷裂， 內生的DNMT3A和DNMT3B在損傷位點檢測到。這些蛋白逐漸積累在第一個5分鐘，至少保持3小時，之後下降。內生的DNMT1也以同樣的方式被招募，但2小時後開始降低，隨後完全消失。CHD4敲除戲劇性減少上述每種蛋白的招募，但或敲除DNMT3A和DNMT3B 或嚴重破壞DNMT1(DNMT1 亞等位基因)對CHD4招募沒有明顯影響。DNMT招募可能導致初期強制雙鏈斷裂DNA甲基化, CHD4在此過程起關鍵作用。在上述激光位點30分鐘沒有5-甲基胞嘧啶 (5mc)出現，但過1個小時到6個小時才出現。 CHD4敲除戲劇性降低5mc積累。CHD4招募從頭開始的DNMTs,DNMT3A,特別是DNMT3B負責DNA甲基化, DNMT3B敲除戲劇性降低積累跟CHD4敲除一樣。相比之下，敲除DNMT1沒有如此明顯效果。

CHD4系牢EZH2和G9a到染色質和DNA損傷修復。

CHD4對招募DNMTs和一些蛋白是必須的，如zeste 2 多梳抑制複合體2亞單元增強子（enhancer of zeste 2 polycomb repressive complex 2 subunit，EZH2)，並建立抑制性的染色質。通過大量的光譜測定，SW480細胞系在H22治療前後，幾個NuRD組件和已知的CHD4相互作用蛋白包括DNMT1, PCNA, HDACs, and PARP1共同參與CHD4免疫活動。也檢測到幾個蛋白以前未知的與CHD4相互作用但已知是與DNMTs 相互作用,包括染色質修飾子和DNA損傷修復蛋白。我們進一步研究EZH2和常染色質組蛋白賴氨酸甲基化轉移酶2 （euchromatic histone lysine methyltransferase 2(EHMT2,也稱G9a)分別作為H3K27me3 和H3K9me2催化關鍵抑制性的組蛋白修飾，都與DNA甲基化基因啟動子有關。免疫沉澱反應中2個蛋白都與CHD4有內生相互作用。氧化損傷戲劇性增加這種相互作用並牢固結合EZH2和G9a到染色質。 CHD4敲除, 不會影響每個蛋白總蛋白水平，但戲劇性降低這些蛋白的染色質牢固結合程度，而敲除EZH2或 G9a不會影響氧化損傷誘導的CHD4對染色質的親和性。因此，CHD4是EZH2和 G9a的上游蛋白.

CHD4也開始僅2分鐘招募內生的EZH2和G9a 到單鏈斷裂部位或雙鏈斷裂部位，然後這些蛋白在微輻射後持續積累至少達30分鐘。CHD4敲除導致戲劇性降低EZH2和G9a的招募。至於其他蛋白研究，敲除EZH2或G9a不會影響內生的CHD4的招募。

以前我們發現基因啟動子雙鏈斷裂和ROS誘導的損傷，活化的組蛋白修飾快速降低和抑制性標誌物產生。也看到其他誘導雙鏈斷裂開始轉錄蛋白也靜默。當一個外源性結構經受一個工程化的l-Scel DNA識別位點的核酸內切酶切割，CHD4, DNMT1, DNMT3，DNMT3B，EZH2, G9a靠近結合雙鏈斷裂位置都富含yH2AX。同時, 這些位點H3K27me3和H3K9me2抑制性標誌物水平明顯增加，而H3K27me3 和H4K16ac激活標誌物降低。敲除CHD4取消這些蛋白增強的動力而保留H3K27me3 和H4K16ac標誌物yH2AX活力。與早時激光誘導的DNA損傷結果一致，敲除DNMT1, DNMT3A, DNMT3B, EZH2, 或G9a不會明顯影響雙鏈斷裂處附近CHD4的豐富程度。而且，各個被招募到雙鏈斷裂處蛋白它們之間沒有關係。類似的結果也在骨肉瘤細胞發現。

CHD4的ATPase活性對招募蛋白到雙鏈斷裂處是必須的。

重要的是，CHD4的ATPase活性域對前所描述的蛋白招募是必須的。 此域負責CHD4 10個核小體和DNA的運動和易接近。當內生的CHD4被Lenti-shCHD4干擾而刪除，取而代之的是標誌物短髮夾RNA (shRNA)耐葯的野生CHD4, 不是ATPase死亡的CHD4,解救招募到DNA損傷部位DNMTs, EZH2,G9a降低。

CHD4是DNA損傷修復的上游功能與抑制的染色質，基因靜默和腫瘤抑制基因啟動子DNA甲基化的關係。

CHD4介導一些事情對重要腫瘤抑制基因靜默和連接到癌症特定的異常啟動子CpG島DNA甲基化很關鍵。在染色質免疫沉澱反應中， CHD4 富含於人類大腸癌組織和細胞系20個代表性基因的啟動子CpG 島。在2個大腸癌細胞系， CHD4隻敲除重新激活這些基因中的8個表達，鈣粘蛋白（E-cadherin，CDH1), WNT 抑制因子1（WNT inhibitory factor 1，WIF1),金屬蛋白酶組織抑制劑金屬鈦酶抑制劑（TIMP metallopeptidaseinhibitor , TIMP2,TIMP3)，mutL homolog 1 (MLH1),周期依賴激酶抑制劑2A（ cyclin-dependent kinase inhibitor 2A(CDKN2A),分泌frizzled相關蛋白（secretedfrizzledrelated protein ，SFRP4，SFRP5)。這些基因的異常靜默可能介導衰老，抑制增殖，抗WNT活性，抑制侵犯和轉移的逃逸。

CHD4和研究的所有蛋白相互作用可能局部於以上基因DNA損傷修復部位，當純雙鏈斷裂在它們的啟動子被誘導，被一個四環素酶誘導系統利用一個Fokl 限制核酶內切酶偶聯到催化死亡Cas9。一個有意義的位置可修復雙鏈斷裂24小時以上，在此期間，yH2AX, CHD4, DNMT1, DNMT3A,DNMT3B,EZH2，G9a富集於誘導的雙鏈斷裂處附近。 同時, 所有腫瘤抑制基因啟動子雙鏈斷裂附近的5mc和抑制標誌H3K27me3和H3K9me2增加,而活化標誌H3K4me3和H4K16ac下降。對於這些改變CHD4起上游作用，敲除CHD4降低每個表觀靜默蛋白和降低5mc和抑制標誌物H3K27me3和H3K9me2積累。這也否定了雙鏈斷裂誘導的降低8個腫瘤抑制基因RNA轉錄。這些數據一起確定了CHD4關鍵作用，在於介導招募導致雙鏈斷裂誘導的腫瘤抑制基因靜默的表觀靜默蛋白的動能。

CHD4結合核組蛋白去乙醯化酶HDAC1和HDAC2，系在一起維持DNA超甲基化的腫瘤抑制基因異常靜默。這些動能也被CHD4調節於上述8個腫瘤抑制基因損傷部位。內生的HDAC1和HDAC21分鐘內被招募到激光誘導的單鏈斷裂和/或雙鏈斷裂處，積累至少15分鐘。CHD4敲除戲劇性降低HDAC1和HDAC2招募。在四環黴素誘導的雙鏈斷裂系統， HDAC1和HDAC2 也明顯在腫瘤抑制基因啟動子DNA損傷修復附近增加，敲除CHD4降低此招募。而且，一起敲除HDAC1和HDAC2也重新激活8個腫瘤抑制基因的表達。此外，如預期假定維持DNA甲基化功能，敲除DNMT1,不是從頭開始的DNMTs, DNMT3A和DNMT3B或其他轉錄抑制調節蛋白G9a或EZH2,導致DNA超甲基化基因增加表達。

隨著氧化DNA損傷，CHD4招募表觀靜默蛋白到啟動子CpG島。在H22治療後，CHD4, DNMT1,DNMT3A, DNMT3B,EZH2, G9a富含於8個腫瘤抑制基因啟動子CpG島，不是在非CpG島基因啟動子(CXCL8和 NANOG)。這些富集蛋白與ROS損傷誘導增強的產物8-羥基脫氧鳥苷(8-0HdG)集聚一起。5mc和抑制性組蛋白修飾H3K27me3和 H3K9me2 也不同地增加，而活化修飾H3K4me3和H4K16ac降低。再一次，敲除 CHD4降低H22誘導5mc和抑制性組蛋白修飾增強，並解救RNA轉錄的減少。此外，H22治療明顯降低高表達包含啟動子CpG島基因的轉錄(MYC, ACTB, RPL13, RPL10A), 這些蛋白因CHD4敲除而消失，但不是非CpG島基因(CXCL8,HBO, MYH1,LAMB4)。

招募CHD4到氧化DNA損傷部位依賴於8-氧鳥嘌呤DNA糖基酶，OGG1

OGG1是氧化損傷修復的一個關鍵蛋白，鹼基截切修復（base excisionrepair，BER)因子移除損傷產物8-0HdG在GC富集區域。CHD4與OGG1形成一個複合體，而H22誘導的氧化損傷戲劇性增加此相互作用。免疫沉澱反應使用純化OGG1和CHD4蛋白揭示OGG1直接與CHD4相互作用。而且，氧化損傷誘導CHD4對染色質親和性增加與OGG1有關，反過來就不是。H22治療後敲除OGG1明顯降低CHD4對染色質結合的牢固性，而過表達的OGG1解救其降低。相比之下，敲除CHD4不會明顯影響氧化損傷誘導的OGG1對染色質親和性的增加。

免疫沉澱反應加入8-0HdG緩衝不會影響OGG1和CHD4相互作用, 說明此相互作用與DNA無關。不過，一個8-0HdG寡核苷酸能摧毀CHD4蛋白在存在OGG1條件下, 說明CHD4結合寡核苷酸通過與OGG1相互作用的情況。而且，CRl8PR介導的敲除OGG1降低H22誘導的8個腫瘤抑制基因啟動子CpG 島CHD4增強。而且，序列ChlP分析,使用抗CHD4抗體在第一次免疫沉澱反應，接著用8-0HdG摧毀，說明在H22誘導氧化損傷後CHD4和8-0HdG佔有腫瘤抑制基因啟動子CpG島同一位置。最後，敲除OGG1也降低H22誘導基因RNA轉錄降低。

重要的, 原發大腸癌樣本腫瘤抑制基因也存在CHD4與OGG1相互作用並因氧化損傷8-0HdG被招募。在序列ChlP實驗中,當第一次免疫沉澱反應可溶染色質與抗體抗CHD4，隨後再次免疫沉澱反應抗8-0HdG或表觀靜默蛋白，8-0HdG, ONMT1,ONMT3A, DNMT3B, EZH2,或G9a與CHD4共占已檢查基因的啟動子CpG島區域。

以前提到，鋅指蛋白MYND類型包含8 (ZMYND8)被鏈接招募CHD4到腫瘤抑制基因。ChlP分析顯示敲除ZMYN08降低腫瘤抑制基因附近CHD4的增強，而敲除OGG1卻不能。此外，敲除ZMYN08對由H22誘導的4個腫瘤抑制基因啟動子CpG島CHD4加強沒有受到影響。因此，我們數據證明招募CHD4依賴於不同的蛋白在ROS誘導的DNA損傷部位和雙鏈斷裂部位。

原發大腸癌8-OHdG, CHD4水平, 啟動子DNA甲基化,腫瘤抑制基因靜默之間關係的預後意義

我們調查上述描述發現的預後重要性。ChlP分析使用新鮮冷凍樣本檢查大腸癌上述8個基因啟動子區域與正常的結腸上皮組織比較，揭示的表觀靜默蛋白(CHD4,DNMT1,DNMT3A, DNMT3B, EZH2, G9a)和氧化損傷標誌8-0HdG的加強。而且, 大腸癌上述每個蛋白加強與8個腫瘤抑制基因啟動子區域8-0HdG 加強有關。此外，CHD4加強與大腸癌上述8個腫瘤抑制基因啟動子CpG島其他表觀靜默蛋白的加強陽性相關(DNMT1，DNMT3A, DNMT3B, EZH2, G9a)。這些研究提出我們觀察到的相關性，ROS誘導損傷和抑制性染色質招募到基因啟動子CpG島也出現在原發大腸癌中。

以上發現對大腸癌具有可能的預後重要性。首先， 8-0HdG水平與侵犯腫瘤行為和差預後有關。而且，上述8個基因負表達及伴隨的增加啟動子區域DNA甲基化也與侵犯行為相關。而且，一起協調高水平的8-0HdG和8個腫瘤抑制基因低表達及異常啟動子甲基化與差預後相關。這些基因存在啟動子甲基化肯定與他們的表達有關。大腸癌患者高水平8-0HdG和8個腫瘤抑制基因低表達及異常的啟動子甲基化，存在最高的複發率和最短的總生存期。

還有一些重要的相關問題。第一，大腸癌CHD4的mRNA水平明顯更高； 第二，CHD4 mRNA表達越高腫瘤複發率越高；第三，CHD4 mRNA表達越高越會發生轉移。CHD4是一個獨立的複發風險預後因子。

總之，8個腫瘤抑制基因高水平CHD4, 8-0HdG,降低表達及異常啟動子DNA甲基化與增加大腸癌侵犯性相關。把大腸癌腫瘤按指標分成4組，陽性CHD4表達,啟動子甲基化，8個基因低表達具有最高複發率和最短的OS。

CHD4調節的腫瘤抑制基因靜默促進了大腸癌的增殖，侵犯，轉移。

重要的是，腫瘤抑制基因靜默是否有助於解釋為什麼CHD4，ROS損傷，基因靜默有以上的預後意義？我們使用已知高侵犯和轉移能力的SW620和LoVo細胞系，注入無免疫的老鼠體內。這可能有助於2個細胞系8個腫瘤抑制基因在CHD4 shRNA敲除後增加表達。在這些基因中， CDH1, WIF1，TIMP2，TIMP3對2個細胞系的侵犯和轉移很重要。敲除CHD4 強有力降低2個細胞系的遷移和侵犯能力，而鈣粘蛋白和WIF1可解救遷移和侵犯能力。敲除TlMP2和TlMP3對遷移沒有明顯影響，但解救侵犯能力。

最重要的是，通過靜脈注射分析敲除CHD4 明顯降低肺轉移和脾種植的肝轉移並增加老鼠生存時間，阻止鈣粘蛋白，WIF1, TIMP2, TIMP3 每個單獨使用shRNA部分解救這些效果。

接著，我們調查MLH1, p16, 8FRP4,8FRP5增殖，活性，生長能力。再一次, 使用shRNA阻止每個基因的重新表達部分解救增殖降低和貼壁無關的生長。類似結果在體內腫瘤生成分析中出現。而敲除CHD4明顯降低2個細胞系腫瘤生長，同時敲除MLH1, p16, SFRP4, or SFRP5每個單獨部分解救此等效果。總之，這些研究提出CHD4介導靜默腫瘤抑制基因促進結腸癌增殖，侵犯和轉移。

（個人看法：雖然文章只針對結腸癌，希望後續在其他癌症中驗證。癌症難治就在於癌細胞總是有辦法生存。更希望早日臨床）

喜歡這篇文章嗎？立刻分享出去讓更多人知道吧！