《細胞》重磅：中國科學家解開男性精子異常不育症的基因謎團，意義非凡！

今天，《細胞》雜誌上刊登了中科院上海生化與細胞所劉默芳研究員團隊的研究，他們首次證明了一個基因的突變是如何導致男性精子異常不育症的，而且還為這類不育症的治療提供了理論基礎和可參考的方法[1]！

劉默芳研究員（右）在實驗室中工作

什麼基因如此重要？它就是Piwi基因（人的Piwi基因稱為Hiwi）。Piwi最早是在果蠅卵巢中被發現的[2]，對幹細胞分裂有調控作用，並且能夠維持生殖細胞細胞分裂的穩定性[3]，它所編碼的Piwi蛋白能夠與雄性動物睾丸內的一種小RNA結合，因此，這種小RNA就被稱為piRNA[4]。這對兒「couple」對生殖細胞基因表達的調控起著非常重要的作用。

早在2013年，劉默芳研究員的團隊就在小鼠模型中發現了一系列和piRNA/Piwi（小鼠的Piwi基因稱為Miwi）相關的有趣的現象和機制[5]。首先，如果想要精子正常形成，那麼Miwi蛋白就要在精子形成的後期階段被降解，否則精子就會「不正常」或是「半路夭折」。

其次，Miwi的降解需要一個酶——APC/C，但是大家要記住，它的降解首先得經過一個「泛素化修飾」的過程。泛素化修飾是什麼呢？其實它是一種很常見的內源蛋白降解的方式，蛋白要與酶的一個成分先結合，然後才能被酶降解，但是也並不是所有的泛素化修飾都會引起蛋白降解。

Piwi蛋白結構

最後，piRNA隆重登場，它在這其中扮演了一個「重要而悲情的角色」，因為它能夠促進Miwi與APC/C的結合，幫助Miwi降解，但同時，Miwi是精子形成後期中唯一一個能與piRNA結合的蛋白，一旦Miwi被降解，失去了結合蛋白保護的piRNA也會迅速被清除。所以，這大概是個「幫助外人解決了自己couple然而自己也不能活命」的悲慘故事。

在這個系列故事裡我們不禁要問，Miwi不能被成功降解的時候，問題是出在哪裡呢？根據當年的研究結果，問題就出在了「泛素化修飾」這個環節上！

通過觀察，研究人員發現，在Miwi的編碼基因中，存在一個D-box（destruction box）序列，很久以前的研究證明，D-box序列對應的蛋白就是與我們前面提到的，酶的一個成分結合的關鍵區域[6]。也就是說，D-box應該就是決定了泛素化修飾是否成功的重要序列。

經過鑒定，研究人員確定了D-box序列上的突變會導致泛素化修飾被減弱或是完全消除。這就意味著，piRNA/Piwi這對兒couple沒有被雙雙「幹掉」，滯留在了精子細胞中，那麼這就不能形成正常的精子了。

人的Piwi序列鹼基組成

當年在小鼠身上的實驗就這樣結束了，那麼這個機制在人的身上是否同樣適用呢？這次的新研究給了我們答案。他們招募了413名無精症男性和300名至少有一個孩子的正常男性，然後對他們的Hiwi基因上D-box序列進行了測序，結果在3名無精症男性的D-box序列上發現了幾個突變，而這些突變在300名正常男性中是完全不存在的。

因為當年在小鼠體內的實驗是「倒推法」找到了D-box序列，因此，這一次，研究人員決定要「正推」一下，直接按照測序的結果構建D-box突變小鼠模型，驗證它們是否是精子異常型不育的原因。實驗結果顯示，經過「改造」的小鼠的精子果然「不對勁兒」了！它們不僅數量少，而且精子中染色質也少，精子頭部還多呈彎曲狀態。

不同階段上精子形成的數量，藍色為正常小鼠，紅色為D-box突變型小鼠

可能有人會問，頭部彎曲怎麼了？事實上，這是一種「精子畸形」。正常精子頭部應該呈前窄後寬的卵圓形，輪廓規則，最前方有清楚透亮的像「帽子」一樣的頂體（特化的溶酶體，在與卵子「相撞」時釋放頂體酶，「解除」卵子的「抵抗」，幫助精子順利進入卵子內）。對照我們下面的對比圖，大家應該就明白了。

正常精子（左）與D-box突變的精子（右）對比，右上圖中黑色尖頭所指均為顯微鏡視野內的畸形精子

那麼，問題又來了，精子的正常結構是如何形成的？其實每一顆精子都是非常辛苦的，因為它們競爭對手眾多，而且路途遙遠，一路從陰道到子宮再進入輸卵管，在輸卵管中遇到卵子後還要穿過卵子透明帶等各種屏障，最終才能成為卵子唯一的「裙下之臣」。

為了讓自己變得「更強」，精子結構在形成時會出現一個獨特的表觀遺傳學調控——組蛋白被魚精蛋白替換。魚精蛋白能夠代替組蛋白與精子中的DNA結合，形成染色質高度濃縮、狀態穩定的DNA-魚精蛋白複合體，並且還會以我們難以想像的方式將自己「安置」在一個極小的空間內，形成精子細胞核[7]。這種變化能夠讓精子更加「靈活」，也保護精子攜帶的遺傳物質不被雌性體內的種種「障礙」破壞。

精子的形成過程，紫色為細胞核，可以看到細胞核逐漸「濃縮」的過程

所以組蛋白被魚精蛋白替換是如何發生的呢？這是2010年的時候，密歇根大學醫學院的研究人員發現的，他們在研究中證明，只有組蛋白中H2A和H2B這兩種發生泛素化修飾之後，替換才能發生，而H2A和H2B的泛素化需要一個連接酶——RNF8介導[8]。

在這樣的前提下，研究人員迅速聯想到，既然這種替換是精子正常結構形成的「必經之路」，而2013年的研究又證明了D-box突變能干擾泛素化修飾，所以是不是D-box的突變影響了H2A和H2B組蛋白的泛素化修飾才導致了精子的畸形呢？

為了驗證這個想法，他們首先對那些改造後精子畸形小鼠的組蛋白泛素化修飾進行了檢測，發現泛素化水平果然降低了！進一步的實驗表明，之所以泛素化水平降低是因為D-box突變導致精子細胞中的Miwi蛋白沒有被降解，而Miwi蛋白可以和RNF8結合，結合後RNF8就無法按照「原定計劃」進入細胞核，介導H2A和H2B組蛋白的泛素化修飾了！看到這裡，大家應該就明白了為什麼改造後的小鼠的精子大都是畸形的了。

從D-box突變到精子異常的發展途徑

最後，研究人員想有沒有什麼辦法能阻止這一「悲劇」的發生呢？於是他們嘗試了將能和Miwi蛋白結合的，RNF8上的一段RNF8-N肽用載體轉進了小鼠體內。結果顯示，RNF8-N肽順利地與精子中「滯留」的Miwi蛋白結合，而其餘的RNF8就「逃過一劫」，像正常發育時一樣進入了精子細胞核中，由此產生的精子形態恢復了正常，而且研究人員還觀察到了它們能正常地「遊動」。也就是說，這種方法「拯救」了無精症小鼠！

總的來說，這項研究為我們揭示了由Piwi基因突變到精子異常型不育的「蝴蝶效應」，而且還驗證了一種「干預手段」，儘管這一手段還只是在小鼠體內適用。我們也希望研究能早日進入臨床，造福廣大有困擾的夫妻！

參考文獻：

[1] Gou L.T, et, al.Ubiquitination-Deficient Mutations in Human Piwi Cause Male Infertility by Impairing Histone-to-Protamine Exchange during Spermiogenesis. Cell. DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2017.04.034

[2]Lin H, Spradling AC (1997). "A novel group of pumilio mutations affects the asymmetric division of germline stem cells in the Drosophila ovary". Development. 124(12): 2463–2476.

[3]Cox DN, Chao A, Lin H (2000). "piwi encodes a nucleoplasmic factor whose activity modulates the number and division rate of germline stem cells". Development.127 (3): 503–14.

[4] Aravin A, Gaidatzis D, Pfeffer S, et al. A novel class of small RNAs bind to MILI protein in mouse testes[J]. Nature, 2006, 442(7099): 203-207.

[5] Zhao S, Gou L T, Zhang M, et al. piRNA-triggered MIWI ubiquitination and removal by APC/C in late spermatogenesis[J]. Developmental cell, 2013, 24(1): 13-25.

[6] Glotzer M, Murray A W, Kirschner M W. Cyclin is degraded by the ubiquitin pathway[J]. Nature, 1991, 349(6305): 132.

[7] Yanagimachi R. Male gamete contributions to the embryo[J]. Annals of the New York Academy of Sciences, 2005, 1061(1): 203-207.

[8] Lu L Y, Wu J, Ye L, et al. RNF8-dependent histone modifications regulate nucleosome removal during spermatogenesis[J]. Developmental cell, 2010, 18(3): 371-384.

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