華中農大棉花團隊成功地在棉花中建立高效CRISPR-Cas9基因編輯系統

近日，我校棉花研究團隊有關 CRISPR/Cas9 技術在異源四倍體棉花中的應用獲得重要進展，相關成果在線發表於植物學主流學術期刊 Plant Biotechnology Journal，題目為【High efficient multi-sites genome editing in allotetraploid cotton (Gossypium hirsutum) using CRISPR/Cas9 system】。依賴於團隊高效的遺傳轉化平台，該研究拓展了 CRISPR 技術在多倍體作物中的應用，為棉花功能基因解析提供重要的技術手段。論文共同第一作者為博士生王鵬程和碩士生張軍， 張獻龍教授和金雙俠教授 為論文的共同通訊作者。

自 2013 年在真核生物中成功應用以後，CRISPR/Cas9 系統成為生命科學研究的關注熱點，成為近年來最受歡迎的基因組編輯系統。該系統具有穩定性強、效率高和操作簡單的特點。利用 CRISPR/Cas9 技術能夠成功實現基因組水平的基因敲除，基因轉錄調控和修飾。目前該技術廣泛應用於動物細胞，植物中在水稻、擬南芥、玉米等模式作物中應用較多，而在多倍體植物，如棉花，油菜中的應用較少。原因在於目前生產上種植的棉花是異源四倍體，有 52 條染色體，基因組龐大、複雜（2.5 Gb，相當於擬南芥基因組大小的 20 倍，水稻基因組的 6 倍），同源重複序列多（70% 左右），同一基因也具有多個拷貝，目前很難獲得有效的單基因突變體。目前在棉花中常規的基因功能研究手段是 RNAi 技術，該技術往往造成同源基因（基因家族）的沉默表達而產生非預期的表型，同時 RNAi 技術往往對靶標基因沉默不徹底，後代中也出現沉默效應不穩定，甚至消失的情況，因此在棉花中開發新型的功能基因組研究手段，勢在必行。

圖片說明 ：CRISPR-Cas9 系統成功敲除棉花基因組中的外源 dsRFP 基因

華中農大棉花團隊至從 2013 年開始，就在棉花中開始了基因編輯的研究工作，包括構建了適用於棉花遺傳轉化體系的 TALEN 載體及三套 CRISPR-Cas9 系統。在本研究使用的載體是本實驗室運用的第三套 CRISPR-Cas9 系統，該系統針對水稻中已有的 CRISPR/Cas9 表達載體進行了改造，使用了棉花內源的 U6 啟動子和合適的抗生素篩選標記。利用一個已經獲得外源報告基因 DsRed2（紅色熒光蛋白基因）的材料為受體進行二次轉化，實現了兩個靶標位點的同時敲除，再生植株的紅色熒光完全消失。另外，以內源的棉花葉綠素合成相關基因 GhCLA1 為靶標設計的三對 sgRNA 也成功實現基因敲除，各靶標位點的編輯效率達到 66.7%~100%，再生植株產生顯著的白化苗表型。對 T0 代植株及其後代的的遺傳分析表明，目標基因可以被突變但沒有脫靶效應，而且這種突變能夠穩定遺傳到後代。本研究創新之處在於充分結合第二代高通量測序技術，實現對大量再生植株突變位點的快速鑒定，大大提高轉基因植株突變鑒定的效率，為實現 CRISPR/Cas9 系統創造棉花基因突變體庫及功能基因組研究打下堅實基礎。目前這一高效的棉花基因編輯載體已經通過合作研究的形式發放給包括澳大利亞聯邦科學與工業研究組織（CSIRO）、浙江大學、南京農大、華中科大、華中師範大學、西南農大、山東農大、石河子大學、中棉所等國內外 10 多家國內外科研機構的同行，共同推動棉花的基因組編輯工作。

本研究獲得十三五國家重點研發專項和轉基因專項基金的大力支持。

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