CRISPR-Cas9更容易發生脫靶突變吸人眼球，已導致一些CRISPR公司股票下降

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上周，一項研究聲稱CRISPR-Cas9基因組編輯技術比預期中的更容易發生錯誤，這讓它成為了全世界的頭條新聞。也因此，一些投資者出售他們持有的基於CRISPR的生物技術公司的股票，這導致一些公司的股票價格下降高達15%。但是，這項最新的CRISPR報道能夠證明所有的這種恐慌是正當的嗎？

圖片來自iStock/Vchal。

開發基於CRISPR的療法的科學家們和公司不同意這一點，指出這種證據存在缺陷。再者，投資公司Cowen生物技術股票分析員Ritu Baral說，早在將這些療法提交給監管結構之前，CRISPR業內人士就充分意識到需要對脫靶突變進行篩選和對技術進行優化。「所有的這一切都在幕後發生著，但是非專業人士和散戶投資者可能沒有意識到這一點。」

在這項於2017年5月30日在線發表在Nature Methods期刊上的研究中，對脫靶效應的分析源自美國哥倫比亞大學的Stephen Tsang及其同事們在2016年開展的一項研究：他們利用CRISPR-Cas9技術成功地修復小鼠胚胎中一種導致失明的基因突變。在該項研究完成後，論文共同作者、美國斯坦福大學眼科醫師VinitMahajan發現有機會研究酶Cas9如何容易發生錯誤。

科學家們總是承認CRISPR並不是完美的。計算機演算法已被開發出來用於鑒定基因組上與嚮導RNA（gRNA）序列存在相似性的位點。迄今為止，已有研究提示著CRISPR技術的脫靶突變率通常是較低的，但是Mahajan解釋道，「我們想要付出我們應有的努力來觀察CRISPR-Cas9是否可能偶然地靶向其他的位點。」

Mahajan和他的同事們對來自他們的2016年那項研究中儲存的組織樣品的基因組進行測序，並且將它們與已發表的小鼠序列數據進行比較。在這些組織樣品序列中存在的但在公共序列資料庫中不存在的突變被鑒定為CRISPR介入導致的脫靶突變。

Mahajan團隊對這些結果感到吃驚：兩隻接受CRISPR處理的小鼠發生的突變比預期中的多10倍。更令人擔憂的是，在這些突變中，沒有一種突變存在於利用計算機演算法預測到的Cas9脫靶位點之內。

Mahajan告訴《科學家》雜誌，「這些全基因組序列似乎在未被預測的區域中發生突變。這提示著利用體外培養的細胞開展的實驗可能並不能較好地預測當被注射到整個有機體內時，CRISPR蛋白是如何作出表現的。」

Mahajan說，利用預測性演算法僅在基因組的蛋白編碼區域中尋找潛在的脫靶位點，可能會遺漏一些突變。非編碼區域「在調節基因和調節細胞中發揮著重要的作用」，但是他承認，「我們迄今為止不能夠預測在這些區域中的突變如何可能影響整個有機體。」他說，儘管這些小鼠存在新的突變，但是在他的研究中，它們看起來很正常。

Mahajan提醒道，「這是一項非常小型的針對性研究：探究了小鼠中的單個基因。我們需要開展更多的研究來理解脫靶效應如何發揮作用，以及它如何在不同的情形下出現。」

澳大利亞國立大學遺傳學家GaétanBurgio說，他對這一發現並不感到吃驚。他說，「不同尋常之處在於這種脫靶效應的幅度」，不過他指出這種結果存在其他的解釋。Burgio告訴《科學家》雜誌，「很多脫靶突變不可能是由CRISPR導致的。」

Burgio繼續說道，這項研究存在的一個重大的缺陷是採用已發表的序列數據，而沒有設置對照小鼠，即放置在相同的實驗室條件下但未接受Cas9蛋白注射的動物。「在你的研究機構中使用的小鼠與那些已被測序過的小鼠存在基因漂移。」Burgio說，由於這一點，這項研究不能夠「梳理出哪些變異體是由於自然的基因變異導致的，哪些變異體是與CRISPR相關的。」

為了支持這種看法，批評者注意到這兩隻小鼠都具有很多相同的純合突變，這意味著相同的變異體存在於染色體的兩個拷貝上。這提示著它們可能是從一個相同的祖先遺傳下來的，而且在進行CRISPR處理之前就已存在於這些小鼠體內。Burgio說，「就我的個人經驗而言」，利用CRISPR-Cas9在兩隻不同的小鼠中「產生兩種完全一樣的點突變是非常罕見的」。

Mahajan承認，「我認為我們不能夠100%確信它們都是由CRISPR導致的。這種CRISPR系統和實驗步驟存在著很多注意事項。」

批評者也聲稱這篇論文存在著明顯的錯誤，比如不正確地鑒定脫靶位點，這可能影響著這些結果的可靠性。Mahajan並沒有提供詳細的反駁意見，但是將這些批評意見描述為是「非常錯誤的」。

不過，這項小型的初步研究足以吸人眼球，嚇壞投資者，比如幾家使用CRISPR基因編輯系統的生物技術公司看到它們的股票價格下降高達15%。Baral說，這種反應是較為罕見的，「但是當你的研究領域非常引人關注時，發生這種情形絕對不是沒有聽說過的。」

作為對這項研究的回應，Intellia Therapeutics公司在發送給《科學家》雜誌的電子郵件中聲稱，「這項研究存在缺陷」，而且「這些作者們沒有為這些所謂的脫靶編輯考慮過其他的更加簡單的解釋」。他們強調，他們正在進行的研究旨在為開發CRISPR療法，「發現治療上相關的gRNA，並且不存在可檢測到的脫靶編輯」。

EditasMedicin公司也同意這一點，在一封電子郵件中寫道，他們「嚴格地評估了我們的分子的特異性」，並且「已證實我們能夠製造出沒有可檢測到的脫靶效應的CRISPR分子」。

Baral說，她認為這些結果並不是引發重大關切的原因。「我認為在進行科學研究時，它會遭遇到非常高水平的安全審查. . . .這提示著這些公司為它們的療法進行臨床前開發所花費的時間是完全合理的。」

Mahajan也仍然保持樂觀。他說，「我仍然對CRISPR感到激動人心」，但是他補充道，學術界需要解決一些問題，比如在真實的組織中發生的脫靶突變率，這些突變對活的有機體的影響。他說，如果脫靶突變與他的數據所提示的那樣比較常見，那麼對患上絕症或衰弱性疾病且沒有替代療法的病人而言，這種風險可能仍然是值得關注的。

參考資料：

1.Kellie A Schaefer, Wen-Hsuan Wu, Diana F Colgan et al.Unexpected mutations after CRISPR–Cas9 editing in vivo. Nature Methods, Published online: 30 May 2017, doi:10.1038/nmeth.4293

2.Was a Drop in CRISPR Firms』 Stock Warranted?

3.Comment to Unexpected mutations after CRISPR-Cas9 editing in vivo

4.潑冷水！Nature子刊「大發現」：CRISPR可引發數百種「意外突變」！

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