酷！Cas9 不切DNA就可以編輯鹼基失活基因

生物極客導讀：

對於高拷貝的基因組而言，如果一旦用CRISPR進行切割，極有可能引發複雜的基因組重組等副反應。來自弗吉尼亞醫學院的科學家們近期在Nature Methods發表文章，使用cas9偶聯上鹼基突變的BE3結構域，通過改變單個核苷酸來敲除基因以產生終止密碼子，結果表明，這種被稱為「CRISPR-STOP」方法是一種有效的、較不有害的替代野生型cas9的基因敲除研究。不僅如此，他們在早期在約7000個人類基因中引入終止密碼子。 CRISPR-STOP介導的靶向篩選顯示與WT cas9相當的功能，表明相應的方法對全基因組功能篩選的適用性。

文章解讀：

CRISPR技術的效率和簡單性在基因敲除（KO）和功能基因組研究中呈現前所未有的功能。在目標位點，Cas9產生雙鏈DNA斷裂，進而由非同源末端連接（NHEJ）或同源性重組（HDR）機制修復。由於插入和缺失（indels）經常引起移碼突變，NHEJ修復機制通常實現基因KO，因此可以實現相應基因功能研究。儘管NHEJ介導的基因沉默非常有效，但最近的研究已經提出了關於使用野生型（WT）Cas9方法進行雙鏈DNA斷裂影響的擔憂。首先，系統引入無法控制的隨機indel，並不是所有的indel都會導致基因KO，有些甚至可能為目標蛋白引入新的功能。其次，更重要的是，WT Cas9的雙鏈DNA切割已顯示導致過度的DNA損傷和細胞死亡，特別是在多拷貝基因組區域。這可能會混淆實驗結論，因為致死性和降解型表型將與靶基因功能無關。在一項具有里程碑意義的研究中，Komor等人最近證實，APOBEC1酶和尿嘧啶糖基化酶抑制劑與切口酶Cas9（BE3）的融合有效地將胞嘧啶（C）轉化成尿嘧啶（U或T） sgRNA的非結合鏈不引起雙鏈DNA斷裂或需要外源DNA模板。

在這裡，科學家們利用這個CRISPR-BE 來改變遺傳密碼並引入早期的密碼子。將BE3靶向包含CGA（Arg），CAG（Gln）和CAA（Gln）的基因的編碼鏈，以分別產生TGA，TAG或TAA終止密碼子。類似地，通過將最後兩個Gs中的任何G改變為A（或非編碼序列中的C至T），編碼鏈中的靶向TGG（Trp）產生TGA，TAG和TAA終止密碼子（圖1a）。為了測試方法的效率，我們在mCherry蛋白的前半部分確定了四個潛在的誘導型停止（i-stop）密碼子。我們將靶向這些密碼子的sgRNA與BE3基礎編輯者或WT Cas9一起短暫轉染到mCherry陽性HEK293T細胞中。為了測量KO效率，使用流式細胞術定量mCherry陰性細胞（mCherry KO）。在用BE3轉染的細胞中，在四種sgRNA（sgRNA2，sgRNA3和sgRNA4）中有三種，觀察到明顯更多的mCherry陰性細胞。這些結果表明，BE3介導的無義突變是報告基因的有效基因沉默方法，儘管BE3蛋白複合物相對於WT Cas9的蛋白表達和/或轉染效率略低。值得注意的是，導致BE3（> 35％的細胞）的最高數量的KOMP3和sgRNA4都以產生終止密碼子的兩個潛在Gs（目標鏈中的Cs）靶向Trp密碼子。

為了證實觀察到的KO效應是由於APOBEC1在BE3複合物中的密碼子編輯催化活性，科學家們在APOBEC1的催化結構域中引入了先前鑒定的8個失活突變（P29F和E181Q）。如預期的那樣，具有突變型APOBEC1的BE3複合物不產生mCherry陰性細胞。此外，與WT Cas9不同，引導BE3與sgRNAs產生同義突變（基本編輯而不改變密碼子）不會導致mCherry表達的丟失。目標DNA測序結果證實了在九個單細胞中的四個（g）引物序列的第四和第八個核苷酸之間的複合物的R環中的特異性C至T轉變。替換率符合mCherry流式細胞術結果。最近的研究已經證明，當靶向高拷貝數基因組區域時，WT Cas9可能導致過度的DNA損傷和隨後的細胞死亡或適應性降低。為了測試WT Cas9在含有高拷貝mCherry基因的細胞中可能是有害的假說，並且這可能是一個似乎合理的原因，為什麼當用WT Cas9靶向時，我們觀察到較少的mCherry陰性細胞，我們產生了含有可變的單細胞克隆mCherry基因的數量。我們在低（2n）和高拷貝數（> 12）mCherry陽性細胞克隆中測試了相同的四種sgRNA。在兩種細胞系中，BE3比WT Cas9更有效地工作。

為了證明CRISPR-STOP對內源基因的可行性，科學家們在多個內源基因座和兩種不同細胞類型中引入了早期終止密碼子。在HEK293T細胞中，在其N末端靶向EHMT2（G9a）和LMNB2基因。用WT Cas9或BE3瞬時轉染相同的sgRNA導致EHMT2和LMNB2蛋白質的降低。此外，在人結腸直腸HCT116癌細胞中LMNB2基因的3 末端敲入mClover的測試了WT Cas9和BE3。該系統允許通過mClover信號強度的熒光激活細胞分選（FACS）分析來進行單細胞級別的KO效率的定量測量。在假二倍體HCT116細胞中引導了WT Cas9和BE3與八個單獨的sgRNA。值得注意的是，觀察到WT Cas9和BE3之間的KO效率水平相當

生物極客點評：

最近開發的鹼基編輯功能展現了前所未有的編輯功能，而且它們擴展了高度通用的CRISPR工具箱，包括上海交通大學課題組在內的多個課題組進行有效的飽和誘變，並進行了成功的高通量前向遺傳篩選。在這裡，科學家們進一步擴大基礎編輯技術的潛在應用領域，並將其作為更安全的基因沉默方法，也可應用於全基因組功能篩選。 CRISPR-STOP方法具有固有的局限性，因為與WT Cas9相比，靶基因的潛在sgRNA數量較少。最近通過使用替代PAM序列擴大CRISPR基因編輯基因組區域的範圍的改進可以克服CRISPR-STOP方法的一些限制。對人類基因組的計算分析表明，CRISPR-STOP方法可用於靶向大量的基因和轉錄本。此外，念驗證表明，這種方法適用於無偏見的大規模遺傳KO篩選。

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