CRISPR可能導致數百種基因突變，基因編輯技術受到質疑

葯明康德/報道

毫無疑問，CRISPR基因編輯技術是近年來生物學領域最為火熱的技術之一。2015年，它曾被《科學》雜誌評為「年度科學突破」，相關應用也曾入選2014與2016年的《麻省理工科技評論》「年度十大科技突破」。人們相信，一個屬於CRISPR的時代已經來臨。

CRISPR技術曾被《科學》雜誌評為「年度科學突破」（圖片來源：《科學》）

然而，昨日在《自然》子刊（Nature Methods）上發表的一篇只有1頁出頭的論文卻發現，在小鼠的體內實驗中，CRISPR技術會引入數百種意料外的基因突變。這則爆炸性的研究迅速成為了生物圈關注的熱點。

要看懂這項研究，我們先來了解下CRISPR-Cas9基因編輯技術的原理。這套系統由兩個關鍵成員組成——負責識別基因組中特定序列的「嚮導RNA」（sgRNA），以及負責剪切的Cas9蛋白。理論上說，通過更改嚮導RNA的序列，這套CRISPR-Cas9系統能夠定位到基因組的任意一個位置，實行剪切與編輯。然而，基因組中過於接近的序列（高同源性）並不少見，一旦充當嚮導的RNA「看走了眼」，就會把Cas9蛋白帶到預料外的地方進行剪切與編輯，帶來潛在的風險。這一現象也被稱為「脫靶效應」。

人們一度相信，CRISPR的脫靶效應，僅僅和互補序列（圖中紅色）的同源性相關（圖片來源：《自然》）

對於這一現象，先前的科學家相信他們早已找到了解決之道——提前找到基因組中序列接近的同源區域不就得了？利用計算機演算法，他們可以很快地找出基因組裡最容易受「脫靶效應」影響的區域，這能帶來兩個好處：首先，在設計嚮導RNA的時候，科學家們可以選擇最不容易產生「脫靶」的序列；其次，在CRISPR完成基因編輯後，科學家們可以反過來去檢驗，這些區域里是否出現了脫靶效應。如果沒有，則說明這次基因編輯非常精準。

看起來很完美，不是嗎？

錯了！隱患依舊存在。

「在細胞系與培養皿中的組織里使用CRISPR後，這些預測性的演算法能幹得很棒，」本項研究的負責人之一，愛荷華大學（University of Iowa）的Alexander Bassuk教授說道：「但我們從來沒有在活體的動物中，利用全基因組測序的方式去評估脫靶效應。」

該研究的主要負責人之一，愛荷華大學的Alexander Bassuk教授（圖片來源：愛荷華大學）

真金不怕火煉。如果我們真的能完美預測CRISPR基因編輯帶來的脫靶效應，那麼即便是使用了全基因組測序，得到的實際結果也應該與計算機演算法所預測的相差不遠。為了驗證這一想法，研究人員首先在細胞系中測試了四種不同的sgRNA，並挑選了活性最高的一種，用於修復小鼠體內的基因突變。後續研究也確認，這些小鼠體內的突變基因的確得到了修復。

然而，在對兩隻接受CRISPR基因編輯的小鼠，以及一隻未接受編輯的小鼠（對照組）進行全基因組測序後，研究人員觀察到了比預計高出許多的基因突變！

在第一隻小鼠中，研究人員找到了164種插入/缺失突變（indels），以及1736種單核苷酸突變（SNVs）。在第二隻小鼠中，同樣出現了128種插入/缺失突變，以及1696種單核苷酸突變。相比之下，對照組帶有的自發突變只有3-4種插入/缺失突變，以及90-100種單核苷酸突變。經過CRISPR編輯的小鼠，突變數上升了一個數量級！

兩隻小鼠（F03與F05）分別出現了大量基因突變，且有68%的突變為兩者所共有（最右一列）（圖片來源：《Nature Methods》）

令人驚訝的是，在這兩隻小鼠的大量突變中，有117種插入/缺失突變，以及1397種單核苷酸突變是兩者共有的，佔到了總突變數的68%有餘。換句話說，這些突變並不是隨機產生的。

更令人詫異的是，這些突變的基因組序列與sgRNA的序列之間，同源性並不高。

讓人驚訝的是，最常出現突變的序列，與sgRNA序列的同源性並不高（圖片來源：《Nature Methods》）

另一個不幸的消息是，這些突變大約一半和已知基因相關。它們可能會影響蛋白編碼、基因轉錄、或是基因調控。

「沒有使用全基因組測序來尋找脫靶效應的研究人員可能會錯過一些關鍵的突變。要知道，一個核苷酸的變化就可能帶來巨大的影響，」該研究的作者之一，哥倫比亞大學醫學中心（Columbia University Medical Center）的Stephen Tsang教授說道：「我們相信，科學界有必要了解所有由CRISPR帶來的脫靶突變，這包括了單個核苷酸的突變，以及在基因組非編碼區的突變。」

本文作者之一Stephen Tsang教授認為全基因組測序在評估CRISPR的脫靶效應中應起到重要作用（圖片來源：Columbia Ophthalmology）

研究人員指出，這項研究表明sgRNA會在目標序列之外，獨立地結合其他基因組位點，帶來新的突變，而這一點「令人擔憂」。儘管這些接受基因編輯的小鼠目前看來一切正常，但不能排除將來出現問題的可能。

目前，研究人員還不清楚造成這一問題的關鍵。改善sgRNA的設計也許能規避這一問題，又或許這是sgRNA帶來的通病，無法完全避免。無論如何，研究人員相信，進一步改善CRISPR-Cas9的精準度依舊有著必要，並能夠回答更多的問題。而在風險未明的當下，在使用CRISPR基因編輯技術，尤其是在臨床的應用中，研究人員呼籲，我們需要像全基因組測序這樣的全面手段，來完整評估脫靶效應造成的影響。

參考資料：

[1] Unexpected mutations after CRISPR– Cas9 editing in vivo

[2] CRISPR gene editing can cause hundreds of unintended mutations

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