Nature Methods最新發表的」CRISPR-Cas9可引起數百個位點突變「可信嗎？

CRISPR-Cas9技術從發現至今被廣泛應用於各種模式生物的基因功能研究，並有望將該技術用於治療基因相關的人類疾病。而該技術目前的難點就是如何解決潛在的脫靶效應。

最新一期的Nature methods報道了一項來自美國哥倫比亞大學醫學中心的關於「CRISPR-Cas9編輯引起基因組上數百個意想不到的基因突變」的研究結果。文章一經發出，基因編輯先驅Editas Medicine的股價下跌近12%。基因組編輯同行CRISPR Therapeutics和Intellia Therapeutics的股價均出現下跌。

該研究提供的數據表明，CRISPR-Cas9可以將「數百種非預期突變引入基因組」，這與CRISPR的精準特點相矛盾。研究人員在用CRISPR技術成功修復導致小鼠失明的基因之後，通過全基因組測序後發現小鼠體內超過1500個單核苷酸發生突變(SNVs)，並有100個以上的位點發生小的缺失或插入(indels)。而且，在sgRNA和脫靶的突變序列之間具有極差的序列同源性，這與廣泛接受的假設「CRISPR主要導致與sgRNA同源區域的indels」相矛盾。該研究還鼓勵相關的研究人員用全基因組測序來檢測CRISPR-Cas9所引起的突變，從而開發出更加精準和安全的基因編輯技術。

在CRISPR-Cas9中，sgRNA的選擇至關重要，sgRNA包含靶序列（crRNA序列）和Cas9核酸酶募集序列（tracrRNA）。crRNA序列是目的基因同源的20個核苷酸序列，將引導Cas9核酸酶活性。sgRNA設計工具可以幫助列出特定DNA區域內可能的crRNA序列，還可以預測其在不同生物體內的脫靶效應，從而選出最特異性的crRNA。

而本研究中使用的sgRNA特異性很差，特異性分數只有54，而同一個exon裡面有一個82分或77分的竟然沒有被選擇。而且我們已經知道，trusgRNA可以減少脫靶效應，增加CRISPR-Cas9的特異性，小分子抑制劑SCR7可以增加基因編輯的效率，本研究也沒有用到，因此結果是否能說明問題令人懷疑。如果他們選擇的是特異性最好的sgRNA，而且用了trusgRNA和提高基因編輯效率的分子，也發現了上百個非預期突變，那結果是令人信服的，也有廣泛的意義。因為大家都知道，隨便挑選一個很差的sgRNA肯定會出現很多預期的或非預期的突變。

該研究結果並沒有真正改變任何東西，除了引起人們更多地關注早期CRISPR治療發展所固有的已經存在的臨床風險。在基因編輯實現其治療和治癒人類疾病的承諾之前，仍有大量工作和新技術需要開發。

參考文獻：

1. Kellie A Schaefer, Wen-Hsuan Wu, Diana F Colgan, et al. Unexpected mutations after CRISPR–Cas9 editing in vivo. Nature Methods 14, 547–548 (2017). doi:10.1038/nmeth.4293.

2. Wu, W.H. et al. CRISPR repair reveals causative mutation in a preclinical model of retinitis pigmentosa. Mol. Ther. 24, 1388–1394 (2016).

3. Fu Y. Sander J.D. Reyon D. Cascio V.M. Joung K.J. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nature Biotechnology 2014 Jan 26; doi: 10.1038/nbt2808. [Epub ahead of print]

4.Maruyama T, Dougan SK, Truttmann MC et al. Increasing the efficiency of precise genome editing with CRISPR-Cas9 by inhibition of nonhomologous end joining. Nat Biotechnol.

2015 Mar 23. doi: 10.1038/nbt.3190. [Epub ahead of print]

喜歡這篇文章嗎？立刻分享出去讓更多人知道吧！