犬CRP—系統性炎症標誌物

C反應蛋白（CRP）是一種主要的急相蛋白。在系統性炎症發作期間，CRP的

濃度水平會迅速顯著升高；隨著炎症原的清除，CRP的濃度水平又會迅速下降至正常水平。在急相應答過程中， 犬CRP（cCRP） 的反應動力學與人CRP類似。當機體受到炎症刺激後，炎症細胞因子會在很短時間內誘導肝細胞合成CRP。CRP同時也在先天免疫應答中扮演重要角色，然而，其具體的生物學功能非常複雜，仍沒有研究透徹。

cCRP可作為診斷標誌物

人CRP已經廣泛應用於炎症診斷及炎症嚴重性評估。若干研究證實cCRP也是一種檢測急相應答非常有價值的標誌物。在病毒或細菌感染、敗血症及子宮積膿等多種炎症性紊亂中均有發現cCRP濃度水平的迅速升高，同時在外科手術中也可以檢測到cCRP的升高（1-3）。

CRP的生化性質

CRP屬於正五聚體蛋白家族。CRP屬於一個進化上非常保守的蛋白家族——正五聚體蛋白，這類蛋白的特徵是鈣依賴的配體結合。正五聚體蛋白的主要功能是保護機體抵禦外來的和變異的抗原（4）。

CRP包含五個獨立亞基，呈環狀結構。CRP的分子量約為115kDa，每個亞基含有204個氨基酸，分子量約為23kDa。人CRP與犬CRP的主要區別在於犬CRP中的兩個亞基為糖基化亞基，而人CRP無多糖存在。

CRP免疫檢測系統的原料產品

在很多情況下，cCRP的免疫檢測試劑使用的抗體為抗人CRP抗體。然而，兩種CRP在血液中經歷的修飾並不相同。通常情況下cCRP為糖基化，而人CRP卻為非糖基化。因此，抗人CRP抗體與cCRP的交叉反應水平很大程度上取決於抗體所識別的抗原表位，尤其是多克隆抗體，因為多抗的批間差會導致差異進一步放大。

HyTest提供若干單抗以及一種重組抗原，這些原料可以用於開發靈敏且特異的犬CRP免疫檢測試劑。我們提供的抗體對於識別犬血清中的CRP具有高度的特異性及靈敏度，並且對抗凝劑不敏感（如EDTA）。我們已經在夾心免疫、直接和間接酶免及蛋白免疫印跡分析系統中對這些抗體進行了測試。同時我們也對這些抗體在其他平台上的應用非常有信心。

重組抗原可以用於配製犬CRP免疫檢測試劑的校準品。

抗犬CRP特異性單克隆抗體

我們有四株特異性和靈敏度俱佳的抗體。這些抗體均可應用於多種平台上的cCRP定量或定性檢測試劑的開發。這些抗體與犬血清中的其他組分無交叉反應，同時與人CRP也無交叉反應。此外，用這些抗體測試貓、馬、兔及山羊血清時也未檢測到反應信號。

其中有三株抗體非常適用於夾心免疫，另一株抗體在直接ELISA及WB平台中表現很好。關於四株抗cCRP單抗的基本性能以及應用推薦請參見表1。

夾心免疫分析系統檢測cCRP

我們對抗cCRP單抗在夾心免疫分析系統中的表現進行了測試。除了cCRP3，所有抗體在夾心免疫分析系統中均可作為捕獲抗體或檢測抗體。單抗cCRP11（捕獲抗體）和cCRP1（檢測抗體）測試天然cCRP的校準曲線參見圖1。在夾心免疫熒光分析系統中，我們推薦的抗體配對具有很高的靈敏度（0.1ng/mL）及很寬的線性範圍。

抗體配對推薦請參見表2。

血清樣本中cCRP的檢測

我們對單抗測試血清樣本中內源性cCRP的能力進行了評價。測試結果顯示，大多數抗體配對均能可靠地檢出內源性cCRP。我們對34例犬血清樣本中的cCRP進行了測試，其中包括患有不同原因的系統性炎症的樣本及8例健康樣本，測試結果見圖2。其中cCRP34和cCRP1分別作為捕獲抗體和檢測抗體。結果顯示，炎症個體樣本中的cCRP濃度顯著高於健康個體。

鈣離子缺失情況下cCRP的檢測

據文獻介紹，有很多cCRP檢測方法使用的捕獲分子為交聯了載體蛋白的磷酸膽鹼（PC）。PC作為特異配體對cCRP具有很高的親和力。然而這種結合非常依賴鈣離子，一旦鈣離子缺失，反應會立即失效。相反，我們的單抗並不會受鈣離子的影響。圖3顯示cCRP11作為捕獲分子，在鈣離子存在與缺失的情況下均可以靈敏地檢出cCRP，而磷酸膽鹼在鈣離子缺失的情況下無法捕獲cCRP。

磷酸膽鹼的結合不會影響抗體對cCRP的檢測

在個體發生系統性炎症及多發傷期間，源於細菌入侵或細胞損傷所產生的磷酸膽鹼可能會出現在血液中，使血液循環中的部分CRP與磷酸膽鹼結合。如果使用磷酸膽鹼作為捕獲分子，可能影響cCRP的檢測。

我們的抗體對於磷酸膽鹼與CRP的複合物並不敏感。使用兩株抗體對CRP進行夾心免疫測定，在磷酸膽鹼存在或缺失的情況下，反應信號並沒有發生變化，具體結果見圖4。

直接ELISA與蛋白免疫印跡

我們提供的cCRP3適合在直接ELISA（圖5）和蛋白免疫印跡平台上進行cCRP檢測。該單抗也可以用於間接ELISA，但是不能用於夾心免疫分析系統。可能因為cCRP3所識別的抗原表位為線性位點，只有抗原被固定於微量滴定板或經過還原性SDS-PAGE電泳後暴露線性位點才可以被識別。

重組犬CRP

HyTest提供重組的犬CRP抗原，含有204個氨基酸，該抗原由真核細胞所表達，純度超過95%。該抗原為部分糖基化，其生化與免疫化學性質與天然cCRP非常相似，可用於配製犬CRP免疫檢測試劑的校準品。

重組cCRP是部分糖基化的

已知犬CRP是一種糖蛋白，據推測，其五個亞基中的兩個被糖基化。在還原性的SDS-PAGE電泳中，天然cCRP的條帶為兩條，上面的條帶代表糖基化亞基（5）。

我們提供的重組cCRP表達於一個可以對蛋白進行糖基化修飾的系統。當純化後的抗原進行還原性SDS-PAGE電泳時，可以發現與天然cCRP條帶類似的兩條分離的條帶（圖6）。兩條下方條帶具有同樣的遷移性，代表著非糖基化亞基。不過代表著糖基化亞基的上方條帶則有略微差異。這說明重組的和天然的cCRP一樣，都只有部分抗原糖基化。然而重組cCRP與天然cCRP抗原在糖基化模式上似乎有所區別。

在SDS-PAGE電泳後，重組蛋白的糖基化亞基由糖蛋白染色進行確認（圖7）。

重組cCRP與天然cCRP在夾心免疫分析中的對比

重組與天然的cCRP抗原在我們內部的DELFIA免疫分析系統中具有相同的滴定曲線（圖8）。在該實驗中，cCRP11與cCRP1分別作為捕獲抗體和檢測抗體。

重組cCRP與磷酸膽鹼的結合

CRP的功能之一是可以在鈣離子存在的情況下與細菌細胞壁的C-多糖結合。其中與CRP反應的主要基團是磷酸膽鹼，該基團存在於C-多糖殘基中。

為了測試重組cCRP是否會同天然cCRP一樣結合磷酸膽鹼，我們用磷酸膽鹼-BSA交聯物在夾心免疫分析系統中對兩種蛋白進行了滴定試驗。結果顯示，重組與天然cCRP的磷酸膽鹼結合能力沒有差異（圖9）。

重組的cCRP為五聚體

為了研究我們的重組cCRP是否可以形成五聚體，我們採用同源夾心免疫對其進行了分析。如果該分子中存在超過一個特異性的抗原表位，那麼使用一種抗體可以同時作為捕獲抗體與檢測抗體。我們將cCRP11同時作為捕獲抗體與檢測抗體對重組與天然cCRP抗原進行了測試，校準曲線如圖10所示。結果顯示，重組的cCRP為一種低聚物。基於這個結果以及其他的一些實驗結果（HPLC、凝膠電泳以及還原性SDS-PAGE電泳；沒有列出），我們可以確認重組的cCRP為五聚體結構。

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