華人科學家成功開發黃病毒NS2B/NS3蛋白酶抑制劑篩選技術

快，關注中國病毒學，一起漲姿勢～

黃病毒屬（Flavivirus）是一類可以引起嚴重疾病的單股正鏈RNA病毒，如登革熱病毒（Dengue virus，DENV）、西尼羅病毒（West Nile virus，WNV）、寨卡病毒（Zika virus，ZIKV）和黃熱病毒（yellow fever virus，YFV）等。然而目前尚無針對該類疾病的特效療法。黃病毒基因組編碼多聚蛋白前體需要通過宿主或病毒編碼的蛋白酶進行切割成為不同的蛋白。已有研究表明NS2B-NS3蛋白酶輔因子NS2B的構象在激活狀態和非激活狀態具有顯著不同的構象。

李宏民教授課題組基於熒光素酶片段互補（split luciferase complementation，SLC）開發一種可檢測NS2B構象變化的方法，並用來篩選潛在的變構抑制劑。當底物類似物結合到蛋白酶活性中心後可引發NS2B構象變化，進而完成熒光素酶信號增強，而參與NS2B構象變化的關鍵氨基酸殘基突變可使其失去構象變化的能力及降低SLC信號增強效應。原文題為「A conformational switch high-throughput screening assay and allosteric inhibition of the flavivirus NS2B-NS3 protease」。

1. 【熒光素酶片段互補方法的建立】

黃病毒NS3為絲氨酸蛋白酶，在三維結構上呈現出經典的雙β桶摺疊，分別為N端β桶和C端β桶（圖一 A）。活性中心位於兩個β桶的中間裂隙。NS2B輔因子來源於NS2B全長靠近細胞質一側的親水區（氨基酸殘基~49-95），其中67-95位之間的氨基酸殘基在蛋白酶活性中心結合底物後發生較大的構象變化（圖一 A-B）進而參與底物與NS3亞基的相互作用。

Brecher等人將熒光素酶的N段區域（氨基酸殘基1-398）融合在NS3蛋白酶119-120位氨基酸殘基之間，熒光素酶的C端（氨基酸殘基398-550）融合在NS2B的羧基端（圖一C）。當底物或底物類似物結合到NS3蛋白酶活性中心後，NS2B輔因子的羧基端同時摺疊到活性中心附近，帶動熒光素酶羧基端與氨基端完成互補，此時可檢測到熒光素酶的信號。如果目標分子不能結合在蛋白酶的活性中心或結合力弱，則無熒光信號或信號較弱。

圖一 基於底物結合的NS2B構象變化及熒光素酶互補原理示意圖

2. 【NS2B構象變化的抑制】

基於建立的篩選策略，該研究發現NSC135618、260594和146771三種潛在抑制劑可以顯著抑制NS2B的構象變化。NPGB可以激活SLC信號，而三種抑制劑在高劑量（40 μM）時可以抑制NPGB對熒光素酶信號的增強效應。隨後將抑制劑的濃度不斷降低，發現低濃度的260594和146771不能抑制NPGB-介導的SLC信號增強作用，而NSC135618仍然可以通過計量依賴的方式發揮抑制作用。該結果表明，NSC135618可以抑制底物類似物誘導的NS2B構象變化。

圖二 潛在變構抑制劑對NPGB-介導的SLC信號增強的抑制作用

3. 【NSC135618是一種廣譜變構抑制劑】

Brecher等人通過體外生化最終篩選到三個可以顯著抑制DENV2蛋白酶的抑制劑：NSC135618（IC50=1.8 μM）、260594（IC50=11.4 μM）和146771（IC50=4.8 μM）且其中僅NSC135618以計量效應的方式發揮作用。隨後以A549細胞細胞系測定三種抑制劑對病毒效價的降低作用。病毒效價實驗證實NSC135618是黃病毒蛋白酶廣譜抑制劑，可以顯著降低DENV2、ZIKV、WNV和YFV的效價（EC50微摩爾級），而半致死劑量僅為48.8 μM。

通訊作者李宏民，目前任職於美國紐約州衛生部Wadsworth中心研究員，同時受聘為美國紐約州立大學奧爾巴尼分校教授，並擔任國際生物化學等多個學術雜誌編輯。李教授課題組主要致力於生物大分子結構和功能研究，以及抗病毒，抗結核，抗真菌藥物研發，在世界頂尖雜誌上發表80多篇學術論文，並取得多項世界級專利。

喜歡這篇文章嗎？立刻分享出去讓更多人知道吧！