細胞培養專題——常見細胞的培養方式

細胞培養專題——常見細胞的培養方式

細胞培養專題—常見細胞的培養方式

1885年，W Roux嘗試使組織離體培養，被認為是組織細胞培養技術的萌芽；1907年Harrison和1912年Carrel開始把組織培養作為一種方法，用於研究離體動物細胞的培養，標誌著細胞培養技術(Cell culture technology)的誕生。細胞培養是指從體內組織取出細胞，模擬體內生存環境，在無菌、適當溫度及酸鹼度和一定營養條件下，使其生長繁殖並維持結構和功能的一種培養技術。目前細胞培養方式主要包括以下三種：

6.1 貼壁培養

貼壁培養主要適用於貼壁依賴性細胞．此類需要相互依賴，需貼附於不起化學作用的物質(玻璃或塑料等無活性物質)的表面生長、生存和維持，並最終在附著面生長至單層，鋪滿平面時便會發生接觸抑制．大多數動物細胞，包括非淋巴組織的細胞和許多異倍體體系的細胞屬於這一類型，他們需要附著於適量正電荷的固體或半固體的表面。

6.2 懸浮培養

來源於血液、淋巴組織的細胞，及許多腫瘤細胞（包括雜交瘤細胞）和某些轉化細胞等屬於懸浮培養型細胞，細胞為非貼壁依賴性細胞，無需支撐面，細胞或細胞聚集體懸浮於液體培養基中增殖．懸浮培養是大規模細胞培養的理想方式，可採用類似於微生物的方法進行懸浮培養。

6.3 固定化培養

動物細胞較微生物脆弱，易受剪切力等的影響，而細胞固定化技術可較好的保護細胞免受機械力及環境變化的影響，提高細胞的耐受力，促使細胞高密度培養，提高目的產物的產率。在傳統的固定化酶技術中，常採用戊二醛、聚丙烯醯胺、聚氨酯等作為固定化細胞載體。但在動物細胞培養中，一般使用較溫和的固定方法，如吸附、包埋、中空纖維或膠囊化等，具有剪切力低、傳遞效果好和抗污染能力強、細胞生長密度高、產物易於收集和分離純化等特點．

由於所培養的細胞的不同，固定化培養的方式也有不同，一般對於貼壁依賴性細胞通常採用膠原包埋，而對於非貼壁依賴性細胞則常用海藻酸鈣包埋。常用的細胞固定化的方法主要有吸附、共價貼附、離子/共價交聯、包埋和微囊化等。

6.3.1 吸附

6.3.1.1 多孔陶瓷

KC.Biologicals公司開發了一種完全自動化的細胞培養系統。該系統的核心是陶質矩形蜂窩狀生物反應器。反應器構型是一圓筒內裝置有許多陶質矩形通道的蜂窩狀圓柱體。通道長30cm，截面積是長方形，約為1mm2，壁厚0.12mm，可提供4.25m2 的生長表面積。這種結構的生物反應器，既可用於培養懸浮生長的細胞，又可用於培養貼壁依賴性細胞。

6.3.1.2 微載體

傳統的貼壁依賴性細胞的培養通過靜止或轉瓶等培養來獲得，操作繁複，且耗費空間及人力．1967年，VanWezel首次提出了「微載體」培養系統 ，經過幾十年的研究改進，微載體培養技術現已廣泛應用於動物細胞的培養，是當前貼壁依賴型細胞大規模培養的主要方法，兼具有平板培養和懸浮培養的有點；能夠使得細胞處在相對均一的環境，溫度、pH、CO2等均等得到很好的控制。較傳統的單層細胞培養，大大增大了表面積，便於控制放大和高密度細胞培養。將這種微載體在流化床式、固定床反應器中進行培養，可獲得比原來多20-50倍的高密度細胞。

6.3.1.3 大孔微載體

人們為了解決微載體培養系統中細胞易受機械損傷的缺陷以及能最大限度地擴大比表面積，開發了具有完全連通溝回的大孔微載體。大孔微載體以纖維素為基質，細胞接種後，大部分可進入載體內部生長分裂，比表面積大，是實心微載體的幾倍甚至幾十倍。在孔內，細胞可以三維生長，同時能避免剪切力或氣泡的影響，細胞密度可達實心微載體的10倍以上。另外，與包埋法相比，傳質尤其是傳氧效果好；且適用於長期維持培養，例如Verax流化床培養系統能維持培養100多天，細胞生長情況依然良好，能在降低培養基血清含量的同時保證細胞和目的產物的產量。因此有人預言，大孔微載體技術將成為動物細胞大規模培養的一種常用方式。

6.3.2 包埋

將動物細胞包埋在各種多聚物多孔載體中而製成固定化動物細胞的方法稱為包埋法。此法步驟簡便，條件溫和，負荷量大，細胞泄露少。因細胞嵌入在高聚物網格中而受到保護，細胞能抗機械剪切。但該法也有一定缺點，如擴散限制，並非所有細胞都處於最佳營養物濃度。包埋法一般適用於非錨地依賴型細胞的固定化。

多孔凝膠是最常用的載體，用於動物細胞固定化的凝膠主要有海藻酸鈣、瓊脂糖、血纖維蛋白等。

6.3.4 微囊化

微囊化培養技術是20世紀70年代由Lin和Sun創建的一種大規模培養技術。微囊化為細胞創造了一個微生態環境，有利於保護細胞。其要點是：在無菌條件下將擬培養的細胞、生物活性物質及生長介質共同包裹在薄的半透膜中形成微囊，再將微囊放入培養系統內進行培養。目前海藻酸鈉-聚賴氨酸-海藻酸鈉微囊技術發展較為成熟。培養系統可採用攪拌式或氣升式反應器系統，Yamamaoto等人設計了微囊與中空纖維膜相結合的新型微囊化技術和反應器。

微囊化培養的優點是：可防止細胞在培養過程中受到物理損傷；活性蛋白不能從囊中自由出入半透膜，從而提高細胞密度和產物含量，並方便分離純化處理。但是由於微囊製作複雜，成功率不高；且製備過程採用化學方法，性質很不穩定，質量標準難以控制。

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