技術貼！如何評估CRISPR系統潛在脫靶效應？

憑藉設計簡單，高效率和低成本，CRISPR/Cas9系統是目前基因編輯的熱門工具。然而近期發表在Nature Methods雜誌上題為「Unexpected mutations after CRISPR-Cas9 editing in vivo」的研究轟動了整個科研圈，通過全基因組測序分析表明，CRISPR基因編輯會引入數百種不可預估的突變到基因組中，引發了大家關於CRISPR系統潛在脫靶效應的熱烈討論。

文章所指出的大規模脫靶問題，對CRISPR的各種應用，尤其是臨床的應用提出了尖銳的挑戰。CRISPR是否真正安全？這些爭論或將促使高深度全基因組重測序成為臨床應用前的檢測標準。本文就CRISPR基因編輯的關鍵步驟和問題進行深入探討，探索高效的解決方法，希望助廣大CRISPR領域研究者一臂之力。

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CRISPR/Cas9系統作用機制

CRISPR/Cas9系統主要包括兩個元件：Cas9核酸內切酶和嚮導RNA。早先發現的guideRNA由tracRNA和crRNA兩部分組成, 兩部分融合表達後，即sgRNA，能夠識別靶DNA序列中保守的前間區序列鄰近基序（Protospacer Adjacent Motifs，PAM），sgRNA通過與Cas9蛋白結合，引導Cas9核酸內切酶定點切割靶向DNA。

圖1. CRISPR/Cas9系統作用機制

如果sgRNA與基因組上其它位置（非靶序列）結合，便會引起脫靶效應，如何設計高效、特異性的sgRNA成為科學界關注的焦點。針對此，設計高效特異性sgRNA和選擇合適的CRISPR核酸內切酶是目前降低CRISPR脫靶效應的兩個主要方向。

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如何降低脫靶效應

高效特異性sgRNA的設計：

（1）對於sgRNA的長度，一般應為20 nt左右；

（2）對於sgRNA序列的鹼基組成，同時sgRNA種子序列盡量避免以4個以上的T結尾，GC%含量最佳為40%~60%；

（3）sgRNA的種子序列與非靶位點的匹配數儘可能低

（4）如果構建U6或T7啟動子驅動sgRNA的表達載體，需考慮sgRNA的5 鹼基為G或GG，以提高其轉錄效率；

（5）對於sgRNA靶向基因的結合位置，如需造成基因移碼突變，需盡量靠近基因編碼區的ATG下游，最好位於第一或第二外顯子；

（6）檢查sgRNA靶向結合位點基因組序列是否存在SNPs或者InDels；

（7）如採用Cas9n，設計paired-sgRNA需考慮成對sgRNA的間距；

（8）全基因脫靶效應分析，需考慮脫靶位點最大允許的錯配鹼基數，建議最少5個鹼基。重點考察種子序列和非種子序列鹼基錯配數，以及脫靶位點是否位於基因編碼區等，另外還可考察是否存在鹼基插入或缺失的脫靶位點。

為了保證CRISPR的成功率，首先針對目的基因設計合成特異性的3-7個sgRNA序列，將sgRNA插入相應載體並製備高質量質粒，然後對構建好的sgRNA載體進行細胞轉染，轉染成功後提取基因組，用T7E1酶切法進行細胞內編輯效率驗證，最後採用TA克隆和測序金標準Sanger測序方法進行細胞株篩選，這樣就可以保證至少有20個陽性克隆結果。

圖2. 基因編輯服務流程

除了設計高效且特異性的sgRNA外，選擇合適的CRISPR核酸內切酶也是降低脫靶發生率的重要因素之一，目前科研人員最常用的CRISPR工具酶載體主要有四種：SpCas9，SpCas9n，SaCas9和Cpf1。其中，SpCas9因可裝入多達7個sgRNA非常適用於科研領域；突變後的SpCas9n脫靶效率遠低於SpCas9，常被用於醫學領域；SaCas9由於遠比SpCas9蛋白小，常被用於病毒包裝研究；Cpf1可裝4個sgRNA，切割雙鏈DNA成粘性末端，遠低於Cas9的脫靶率，適用於醫學領域。因此，針對特定的科研方案，需要選擇對應的高效工具酶進行實驗。

下表1中展示這幾種載體的主要特徵及應用領域：

表1 不同工具酶載體之間的特徵比較

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如何進行細胞株高效篩選

在進行目的基因編輯時，對基因敲除單克隆細胞株篩選一般採用傳統的檢測方法即隨機抽樣檢測法進行檢測；首先挑選一些克隆進行Sanger測序，根據測序結果進行次級篩選，然後挑克隆測序，根據結果再次篩選，最終得到基因敲除單克隆細胞株。但是，傳統的挑斑篩選的統計方法，通量較小，不適於大量的克隆快速篩選研究方案，而且隨機的人為取樣會影響編輯效率數據的準確性，同時存在漏挑的可能性，進而影響整體實驗周期。

如何從大量的細胞中快速篩選得到基因敲除單克隆細胞株一直是一個難題，為了解決這一難題，金唯智自主研發GeneEditing-NGS-Genotyping技術，利用NGS測序技術可大規模對突變細胞株進行篩選，並通過測序Reads定量檢測特定克隆的突變率以及突變類型，可在短時間內篩選出特定突變類型的陽性克隆。

首先，我們分別對96孔板中的細胞進行基因組抽提，然後加barcode操作混合成sample pool建庫測序。測序下機後，獲得的原始數據經過濾去接頭、去污染、質控合格後與靶序列比對。統計出靶區域InDels，通過分析InDels所造成的突變類型，最終在短時間內篩選出特定突變的陽性克隆，流程如圖3所示：

圖3. GeneEditing-NGS-Genotyping流程

相比於傳統Sanger測序方法，該技術具有無可比擬的優勢：短時高效，為我們的科研工作者節約寶貴時間；分析全面，準確度高，確保每項實驗數據的準確無誤；可同時針對多個靶位點進行篩選，省去繁瑣的重複實驗操作；自動化實驗流程可以極大的避免了人工操作的誤差；嚴格的質控體系和專業的技術分析團隊可保證數據的真實可靠。

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全方位脫靶分析

作為常規的科研工具，這一被稱為「魔剪」的基因編輯工具在基因治療應用方面也被寄予厚望。但是，困擾其它定向核酸酶的老問題——脫靶效應，也同樣影響著CRISPR系統。研究人員發現CRISPR會帶來大量的非靶序列的SNVs和InDels，這些突變涉及了基因組的編碼區和非編碼區。重要基因的關鍵鹼基突變有可能會直接影響機體的生理功能，如果CRISPR系統引入非靶序列的大量突變，這將大大影響對CRISPR的臨床應用。

在臨床轉化中，使用準確尋找脫靶位點的方法有重要意義。目前，主要是通過計算機模擬預測sgRNA脫靶位點，但正如文章所提到的，預測的脫靶位置並未發生基因突變，而未預測到的脫靶位點卻發生了大量突變，說明目前預測的脫靶的演算法存在一定的局限性，由此看來，我們需要在全基因組水平上評估脫靶效應造成的影響。基於此，金唯智推出CRISPR-高深度（50X）全基因組重測序，該方法能全方位精準地對基因編輯的細胞或個體進行off-target檢測。

高深度的全基因組測序對於檢測由CRISPR脫靶引起InDels將更為準確。如圖4所示：下機數據經過數據質控得到clean reads，與參考基因組比對統計單核苷酸變異(SNV) 、插入/缺失（InDels）位點數量及位置信息，從而在全基因組範圍評估CRISPR off target效應。同時，我們還可以對SNVs和InDels位點進行基因功能注釋。

圖4. 基於高深度全基因組測序的脫靶分析

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總結

正如大家熱切討論的，CRISPR基因編輯技術正處於爆髮式的進展中，未來的應用必將涉及生命科學和臨床轉化等各個領域，和我們的生活密切相關。基因合成和高通量測序將助力CRISPR基因編輯技術更快速更精準。首先，設計高效特異sgRNA和選擇合適的CRISPR核酸內切酶在實驗前期減少脫靶效應，然後採用GeneEditing-NGS-Genotyping方法進行單克隆細胞株篩選大大提高通量縮短周期，最後，通過高深度（50X）全基因組重測序在全基因組範圍內精準地對基因編輯的細胞或個體進行脫靶檢測，多重把關多重設計讓實驗進程更快更精準。以上為我們對CRISPR基因編輯技術的一些見解，希望能拋磚引玉引起大家廣泛的討論。

參考文獻：Schaefer K A, Wu W H, Colgan D F, et al. Unexpected mutations after CRISPR-Cas9 editing in vivo[J]. Nature Methods, 2017, 14(6): 547-548.

Nishimasu H, Cong L, Yan W X, et al. Crystal structure of Staphylococcus aureus Cas9[J]. Cell, 2015, 162(5): 1113-1126.

Kuscu C, Arslan S, Singh R, et al. Genome-wide analysis reveals characteristics of off-target sites bound by the Cas9 endonuclease[J]. Nature biotechnology, 2014, 32(7): 677-683.

Zetsche B, Gootenberg J S, Abudayyeh O O, et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system[J]. Cell, 2015, 163(3): 759-771.

Cong L, Ran F A, Cox D, et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems[J]. Science, 2013, 339(6121): 819-823.

Pattanayak V, Lin S, Guilinger J P, et al. High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed Cas9 nuclease specificity[J]. Nature biotechnology, 2013, 31(9): 839-843.

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