《Cell》系列：我像爸爸還是媽媽？——美國遺傳學家利用原位檢測單/雙等位基因在腦內表達的時空差異

表觀遺傳研究顯示，某些等位基因表達呈現genomic imprinting，也有一些屬於random X inactivation。Genomic imprinting的存在導致個體只表達非imprinting一方的表型，也就是說如果爸爸的某個位點的基因被imprinting，那麼只有媽媽的這一位點基因表達。Random X inactivation出現在雌性哺乳動物體內，由於存在兩個X染色體，雌性動物細胞內會隨機失活一條X染色體基因的表達，這種失活狀態將貫穿細胞生命的始終且在其子代細胞中同樣保持失活狀態。隨著表觀遺傳學的深入研究，人們發現genomic imprinting只在小鼠和人的不到200個常染色體基因中存在，這提示在常染色體中大部分父親和母親來源的等位基因表達的機會仍然一半一半。但事實上，常染色體的表觀遺傳等位基因特異表達（Autosomal, epigenetic allele-specific expression (ASE)）效應顯現出單等位基因效應（monoallelic），例如抗原受體，嗅覺受體等。而這些單等位基因效應經單細胞轉錄組研究表明，很少像randome X inactivation那樣是隨機發生的。所以問題就來了——既非imprinting，又不是隨機（random）發生的，那麼究竟是什麼決定了我們表達爸爸還是媽媽的等位基因呢？

為了回答這個問題，首先需要了解機體不同細胞內單等位基因和雙等位基因的表達趨勢。遺傳學和精神病學家Christopher Gregg等人多年來一直致力於腦組織細胞內等位基因的表觀遺傳研究，並於2015年和2017年先後在《Cell》子刊《Cell Reports》和《Neuron》上發表了兩篇文獻[1, 2]，描述小鼠不同腦區細胞內等位基因的表達趨勢，包括非典型imprinting，單等位基因（monoallelic），雙等位基因（biallelic）等表達模式。並針對那些在鼠，獼猴和人腦內保守的非遺傳性等位基因表達模式與精神系統疾病的相關性進行了研究。

通過對基因組學和RNA測序的大量數據分析，Gregg團隊得到了很多不同腦區細胞內單等位基因和雙等位基因表達的數據；那麼在真實的腦組織中，這些等位基因在對應的細胞內是否真的呈現相應的表達模式呢？為了直觀地觀察數據統計得到的結果，Gregg等人通過RNAscope技術針對等位基因的轉錄進行了原位檢測，實現了多年來首次原位對等位基因的轉錄進行研究。

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視頻來源：www.cell.com網站

我們來看一下Gregg是怎樣實現這個實驗設計的：

通過特異性針對等位基因上轉錄出的nascent RNA的內含子（intron）進行探針設計。由於RNAscope技術只檢測RNA而非基因組DNA，故intron probe可以檢測等位基因被轉錄出來後存在較短時間內的nascent RNA，而當nascent RNA被修飾後，內含子部分被剪切掉，成熟的RNA進入到胞漿或者在細胞核內行使其相應的功能。正是由於nascent RNA被轉錄出來後只短時間內聚集在細胞核內，故通過intron probe可以直接觀察到位於細胞核內，相距較遠的兩個等位基因轉錄出的nascent RNA。理論上，當只有一個等位基因被轉錄時，細胞核內可以觀察到單簇nascent RNA聚集成的信號點；而當雙等位基因都發生轉錄時，細胞核內可以觀察到兩簇nascent RNA聚集成的信號點。

Gregg等人的實驗結果顯示通過這一方法確實可以在細胞核內原位檢測單等位基因表達和雙等位基因表達。下圖C和D為原位驗證genomes和RNA-seq分析得到的小鼠Bmp4和Mtap1b在腦內中縫核（dorsal raphe nucleus, DRN）和背側導水管灰質區內等位基因的轉錄結果。圖C顯示只有一個Bmp4 nascent RNA信號點，提示該腦區的Bmp4為單等位基因轉錄（橘色箭頭所示）；圖D中的大多數細胞呈現雙Mtap1b nascent RNA信號點，提示Mtap1b為雙等位基因轉錄模式（藍色箭頭所示）；

同時，通過RNAscope直接檢測成熟的RNA，即對基因RNA的外顯子區域設計特異性探針。實驗中小鼠的某個等位基因分別攜帶野生型和LacZ突變型基因（例如Bmp7+/LacZ），Gregg等人針對野生型基因（Bmp7, Bmp4或Ador2b）和LacZ設計探針，並使用RNAscope duplex assay（貨號：322430）在細胞內可以同時檢測野生型（藍色）和LacZ突變型（紅色）基因的轉錄，來觀察等位基因的表達趨勢。例如下圖A中，分別為Bmp7, Bmp4和Ador2b三個基因野生型與其lacZ突變型雜合子在不同細胞內的表達模式。WT only細胞內只有野生型基因的mRNA發生了轉錄；WT dominant細胞內野生型等位基因的轉錄佔主要部分，有個別LacZ突變基因發生轉錄；Biallelic細胞內則同時有相似數量的野生型與LacZ突變型等位基因的mRNA發生轉錄；LacZ dominant和LacZ only的細胞內則主要或者只有LacZ突變基因發生轉錄。

結合對nascent RNA以及成熟mRNA的RNAscope原位檢測方法，下圖C和D很好地在細胞內原位詮釋了單等位基因和雙等位基因轉錄模式從nascent RNA到成熟RNA的過程。下圖C顯示Bmp7 nascent RNA在弓狀核（arcuate nucleus (ARN)）內為單等位基因轉錄模式（橘色箭頭所示，細胞核內有一個nascent RNA信號點），而在腦膜內為雙等位基因轉錄模式（藍色箭頭所示，細胞核內有兩個nascent RNA信號點）；下圖D為使用RNAscope duplex assay雙染技術發現Bmp7在ARN中只有野生型等位基因發生轉錄（藍色信號點）；而在腦膜內，Bmp7既轉錄野生型等位基因（藍色信號點），也轉錄LacZ突變等位基因（紅色信號點）。

等位基因在大腦發育過程中出現的時空表達差異，為多種神經功能發育和疾病發生機制提供了新的信息。基於RNAscope原位檢測技術，Gregg等人對腦內等位基因的表達進行了大量的驗證實驗。發現新生5天，15天鼠腦和成年鼠腦內的中縫核內（dorsal raphe nucleus, DRN）等位基因的表達趨勢存在很大差異。由於中縫核內含有大量serotonergic能神經元的胞核，其突觸投射到前腦參與神經調控，故該與多種神經疾病和精神系統疾病有關。在新生鼠的DRN區域，雙等位基因表達（CoEEs）比率比生後15天以及成年鼠腦高50倍，提示機體在發育階段該區域對雙等位基因細胞仍然存在基因表達的選擇性。新生5天中縫核的常染色體基因也有呈現單等位基因表達的，這些基因大多與DNA修復功能具有顯著相關性。

RNAscope技術是由美國Bio-techne旗下Advanced Cell Diagnostics(ACD)公司研發的RNA原位雜交產品，在近年來的生物檢測領域發展迅速。與傳統的RNA原位雜交相比，RNAscope技術屬於新一代RNA原位雜交技術，其特異性的雙Z探針設計避免了傳統長鏈RNA探針的弊端，配以自身級聯放大檢測原理，可以高效敏感地檢測到目標RNA。該技術優勢如下：

1. 應用廣泛: 使用RNAscope技術，靶點RNA為大於等於300個鹼基的特異序列，即可進行探針設計。因而RNAscope技術可以應用於幾乎所有物種，所有組織以及所有基因的檢測。

2. 特異性：RNAscope獨特的雙Z（ZZ） 探針設計有效的防止了探針的非特異性結合，同時降低了背景干擾。由於結合在非特異性位點的單個的Z 探針不會產生完整的信號放大分子結合位點，並會在雜交過程中被洗脫掉，從而防止非特異性信號的放大，使得探針的信號具有高度特異性。探針設計合成需要2~4周時間即可完成。

3. 靈敏度：RNAscope方法檢測每個RNA 分子時，只需三對雙Z（ZZ）探針即可完成雜交和信號可視化。

4. 單分子可視化和單細胞定量: 使用RNAscope技術雜交上三對及以上雙Z 探針即可在標準的顯微鏡下呈現可觀察到的點狀信號。ACD公司提供的分析軟體更可以定量每一個單細胞內RNA 的表達水平。

5. 兼容降解的RNA: 由於RNAscope三對雙Z探針即可檢測到目標RNA，而通常針對靶點RNA設計的探針為20 對雙Z 探針，因而即使目標RNA發生部分降解，仍可以穩定有效地檢測到靶點RNA。

6. 檢測結果穩定一致性：由於工業化合成RNAscope技術用到的探針以及所有檢測試劑，且該技術針對不同樣本類型（冰凍切片， 石蠟切片，懸浮細胞，貼壁細胞等）已經有成熟的實驗操作流程，故使得RNAscope技術檢測結果具有穩定性和一致性。除了可以在實驗室進行手工操作外，該產品也可以在Leica以及羅氏Ventana自動平台上運行，為結果的一致性和穩定性提供了可靠的依據。

7. 多通道多靶點同時檢測：由於RNAscope技術可以同時進行多通道探針雜交以及信號放大，故在可見光檢測中可以在同一張切片上同時檢測兩個靶點；而在熒光檢測過程中，可以在同一張切片上檢測三個或三個以上靶點RNA。

Reference:

1.Cell Rep. 2015 Aug 11;12(6):979-91. doi: 10.1016/j.celrep.2015.07.017. Epub 2015 Jul 30. Noncanonical Genomic Imprinting Effects in Offspring;

2.Neuron. 2017 Mar 8;93(5):1094-1109.e7. doi: 10.1016/j.neuron.2017.01.033. Epub 2017 Feb 23. Diverse Non-genetic, Allele-Specific Expression Effects Shape Genetic Architecture at the Cellular Level in the Mammalian Brain.

RNAscope技術不但能夠進行腫瘤組織中標誌物的原位檢測，而且在神經生物學上也有著廣泛的應用，該技術實現了對大腦組織等神經標本的原位定量和定位分析，結果清晰準確。

來源：生物谷

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