獨家專訪《Cell》中國學者首次發布大規模腫瘤單細胞水平免疫圖譜

關鍵詞：肝癌 免疫T細胞 單細胞測序 新靶點

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2017年6月16日，《Cell》雜誌發布重大研究成果，首次在單細胞水平上描繪了肝癌微環境中的免疫圖譜，通過對超過5000個T細胞的單細胞測序數據及分析，發現可能的肝癌靶點基因，基因慧對此次課題的通訊作者張澤民教授進行了獨家採訪並深度報道如下。文獻鏈接見文末。

圖1： 腫瘤免疫細胞單細胞測序技術路線。圖片來自《Cell》

1. 北大、世紀壇醫院、Amgen合作

技術研發和轉發跟進

學校、醫院和藥廠協同

跨機構、跨國合作，包括：

北大學生命科學學院BIOPIC中心、北京未來基因診斷高精尖創新中心、北大-清華生命科學聯合中心張澤民研究組

首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院暨北京大學第九臨床醫學院肝膽胰外科彭吉潤研究組

美國AMGEN公司的歐陽文君研究組

作為共同通訊作者在《Cell》雜誌發表了題為「Landscape of infiltrating T cells in liver cancer revealed by single-cell sequencing」 的研究論文，首次在單細胞水平上描繪了肝癌微環境中的免疫圖譜。

北京大學生命科學學院BIOPIC中心博士後鄭春紅，博士研究生張園園、郭心怡，前沿交叉研究院博士研究生鄭良濤，北京大學醫學部博士研究生郭化虎和美國AMGEN公司博士後Jae-Kwang Yoo為該論文的並列第一作者。

2. 探索肝癌新靶點和生物標記物

肝癌組織內富含大量腫瘤浸潤淋巴細胞

肝癌免疫治療鮮有報道

單細胞測序解決異質性問題

中國肝癌發病率居世界之首，且術後存活率較低，之前的研究表明肝癌組織內富含大量腫瘤浸潤淋巴細胞。

癌症免疫療法是近年新興的極具潛力的治療方法，尤其是免疫檢查點抑制劑療法，如CTLA-4抗體Ipilimumab及PD-1抗體pembrolizumab目前都取得良好的療效。但是相比於免疫療法在黑色素瘤及肺癌等腫瘤上的成果，目前成功的針對肝癌的免疫治療方法卻鮮有報道。

單細胞腫瘤組學研究為什麼受到重視？雖然免疫治療可以達到顯著的臨床效果，但是在不同病人或者不同癌種之間的效果卻很不均一。DNA變異的數目、腫瘤浸潤淋巴細胞的水平以及藥物靶點的表達等因素都會影響到各類腫瘤免疫治療的效果。由於參與腫瘤發生髮展的免疫細胞類型多樣且異質性很強，只有開展單細胞水平的研究才能真正獲得系統詳盡的腫瘤免疫圖譜，從而助力於腫瘤免疫療法的發展及有效的靶點和生物標誌物的發現。

腫瘤靶點和生物有效標誌物是新葯研究重難點之一。通過深刻了解肝癌的腫瘤免疫微環境來探索新的腫瘤免疫療法及尋找新靶點和有效的生物標誌物，對於肝癌的診斷和治療具有重大意義。

3. 探索技術路線

單細胞測序：超過5000個T細胞的數據

轉錄組及TCR序列分析

基因慧：這項研究中，據稱通過血液和細胞都進行了單細胞測序和常規DNA/RNA測序，最後得到轉錄表達譜和TCR序列圖譜，您能簡要談談技術路線嗎，其中有哪些突破和創新呢？

張澤民教授：近年來，近年來，單細胞轉錄組測序技術已經快速發展，並被廣泛用於癌症研究。之前《科學》雜誌報道了採用單細胞測序技術對黑色素瘤中的浸潤T細胞的特質研究工作，但對T細胞的分型相對簡單，樣本採集部位單一且數量較小。本課題組通過對外周血、癌旁和腫瘤三個部位的T細胞進行採集分析，能夠發現腫瘤特異的T細胞亞群以及表達譜、TCR譜特徵，對研究腫瘤免疫機制具有指導性的意義，大規模的樣本量和深度測序能使我們獲得更多的結果和更深層次的發現。此外，不同於之前僅關注於基因表達分析的單細胞研究，本研究使用國際領先的生物信息學方法對單細胞轉錄組數據進行分析，同時得到了單個T細胞的基因表達圖譜並組裝出其所對應的TCR序列，從而不但可以分析單個T細胞的免疫狀態還能追蹤不同T細胞的來源及家譜，立足於T細胞的獨特特徵從多角度對T細胞的功能和免疫學特徵進行分析研究，進而揭示腫瘤中T細胞的特有狀態並研究了腫瘤中T細胞的狀態轉換過程。

4. 研究成果

亞群特異基因表達

CD8 T細胞的功能紊亂及抑制性T細胞特異表達基因

描繪了初始T細胞向耗竭狀態的發展軌跡

在耗竭性CD8 T細胞亞群中發現了一類FOXP3+抑制性T細胞的存在

基因慧：張教授，這次在《Cell》上發表的科研成果，據說是國際上首次大規模針對腫瘤相關T細胞的單細胞組學研究，您能通俗地向基因慧讀者談談這項研究成果嗎?

張澤民教授：我們的這項研究成果主要是在單細胞水平對肝癌腫瘤微環境中T淋巴細胞的轉錄組及T細胞受體(TCR)序列進行綜合分析，基於生物信息學分析，通過對T細胞進行亞群分類、發展軌跡分析及比較不同亞群中T細胞克隆的分布，來探索不同亞群之間的關係並鑒定每個亞群特異的基因表達，從而揭示腫瘤中的T細胞在功能、分布和發展狀態等方面的獨特性質。腫瘤在免疫系統中出現逃逸的主要原因包括殺傷性CD8 T細胞的功能紊亂及抑制性T細胞的大量存在，針對這兩類細胞尋找靶點是免疫療法的主要方向。我們的研究著重探索了腫瘤中這兩類細胞的特異表達基因，發現基因Layilin在這兩群細胞中均特異性表達，並通過體外實驗證明該基因對於CD8 T細胞的殺傷功能有抑制調節作用，可能作為一個免疫療法的新靶點。同時，基於TCR數據分析，我們的研究發現肝癌內存在大量腫瘤組織特異的克隆增生的T細胞，但是這些細胞大多處於耗竭狀態，從而揭示了腫瘤細胞逃逸免疫監視的原因。此外，我們的研究還描繪了初始T細胞向耗竭狀態的發展軌跡，並在耗竭性CD8 T細胞亞群中發現了一類FOXP3+抑制性T細胞的存在，提出了耗竭T細胞會進一步發展成抑制性T細胞的潛在發展方向。

5. 展望落地臨床

為後續了免疫療法提供了新的潛在靶點

驗證了個別基因的功能，動物模型和臨床試驗還待進行

基因慧：課題組發現殺傷性CD8 T細胞和抑制性T細胞的特異表達基因，這對於臨床有什麼指導意義呢？未來如果落地臨床，還有哪些工作要做呢？

張澤民教授：基於T細胞的治療方法是目前最為成功的癌症免疫療法，因此研究癌症中T細胞與腫瘤微環境的相互作用機製成為打開新免疫療法寶箱的鑰匙，尤其是免疫檢查點抑制劑療法，如CTLA-4抗體Ipilimumab及PD-1抗體pembrolizumab目前都取得良好的療效，而這種免疫檢查點抑制劑療法正是基於「喚醒」殺傷性CD8 T細胞的功能或者抑制抑制性T細胞的功能來實施治療的，因而分別針對「功能紊亂」的殺傷性CD8 T細胞和抑制性T細胞來尋找他們的特有基因將有助於尋找新的治療靶點。最終，我們找到了多個特異性的靶點並初步驗證了個別基因的功能，為後續了免疫療法提供了新的潛在靶點，當然大量的後期驗證工作，例如小鼠等哺乳動物模型的驗證，以及大量的臨床試驗等還有待進行。

圖2： 肝癌單細胞測序。圖片來自《Cell》

6. 肝癌免疫圖譜和新葯研發

單細胞水平的研究來獲得系統詳盡的腫瘤免疫圖譜

助力於有效的靶點和生物標誌物的發現

初步驗單細胞轉錄組數據分析得到一個靶點抑制CD8 T細胞的殺傷性功能

基因慧：這次合作Amgen參與其中，您對於肝癌免疫圖譜和新葯研發的意義有多大，中間的距離有多遠？

張澤民教授：中國的肝癌發病率居世界之首，目前主要的治療方法還是以手術及放療/化療等傳統方法為主，而新興的極具潛力的相關癌症免疫療法卻鮮有報道，這就需要我們深刻了解肝癌的腫瘤免疫微環境來探索相應的腫瘤免疫治療方法。通過開展單細胞水平的研究來獲得系統詳盡的腫瘤免疫圖譜，會極大地助力於腫瘤免疫療法的發展及有效的靶點和生物標誌物的發現。本課題的合作方Amgen公司是一家有豐富新葯開發經驗的知名企業，項目合作方的主要負責人歐陽文君博士及其所領導的團隊擁有豐富的免疫學知識及新葯研發能力。截至目前為止，Amgen研究團隊已經初步驗證了單細胞轉錄組數據分析所得到的其中一個靶點的功能，結果表明這個基因確實對CD8 T細胞的殺傷性功能有抑制作用，後續更多的功能驗證及其他潛在靶點的研究正在進行中。

7. 學校、醫院、藥廠協同合作

大膽嘗試最新的生物信息學分析方法，如細胞聚類及TCR序列組裝等

免疫領域及應用轉化，拓展研究意義

基因慧：這次課題在北大-清華，北京世紀壇醫院，Amgen公司這樣科研、臨床和產業的三方合作下，由您領導的研究組和彭吉潤研究組及歐陽文君研究組共同完成，您能談談這樣跨組織合作中的關鍵點是什麼呢？其中有哪些可以分享的故事呢？

張澤民教授：首先，我很感謝課題的合作方北京世紀壇醫院的彭吉潤研究組和Amgen公司的歐陽文君研究組。對於這種多方合作、多角度研究的大項目，不同課題組之間的高效協同作業，最大限度地發揮每個團隊的力量是整個項目順利開展的關鍵因素。在項目初始階段，我們和彭吉潤研究組的同學通力合作，探索了整個項目的具體實施細節，包括病人入組條件、取樣要求、單細胞轉錄組擴增方法等，同時還發揮了本研究組生物信息學分析的優勢，大膽嘗試最新的生物信息學分析方法，如細胞聚類及TCR序列組裝等，從而保證項目的高效推進和運行。到項目後期，Amgen公司歐陽文君研究組的加入進一步加強了本課題在免疫領域及應用轉化方面的研究，從而進一步升華了整個課題的意義，這些對於整個課題的最終完成都有重要意義。

8. 科技部「精準醫學」專項資助

把基礎研究和轉化研究緊密融合

學校、醫院和製藥企業的協同攻關

基因慧：在科技部2016年啟動的「精準醫學專項」中，您的課題組承擔了項目，這次研究是否屬於這個專項呢？我們陸續啟動大規模的組學技術研發項目，您參與其中，對於產學研的合作有什麼體會和對未來的期待呢？

張澤民教授：這項工作確實由「精準醫學專項」中的「臨床用單細胞組學技術研發」項目資助，同時本項工作也得到了國家自然基金、北大-清華生命科學聯合中心和北京未來基因診斷高精尖創新中心的資助。我們感謝各項基金對我們工作的支持。相比於十年前，現在從基礎研究到藥物研發之間的轉化時間越來越短，甚至可以說是齊頭並進，把科研武斷地分割成基礎研究和轉化硏究已經是一個過時的概念。我曾經在基因泰克工作多年，有豐富的工業界做科研的經歷，把基礎研究和轉化研究緊密融合一直是我追求的科研模式。這個項目中學校、醫院和製藥企業的協同攻關恰恰體現了產學研結合的趨勢，我們會繼續這樣的模式，把我們的技術和經驗推廣到更多的癌症類型上去。

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文章鏈接：http://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(17)30596-2

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