環狀RNA與免疫反應：NF90/NF110調控環狀RNA生成和抗病毒免疫反應

NF90/NF110調控環狀RNA生成和抗病毒免疫反應

導語

人類基因暗物質「環形RNA」又被「發掘」一項新功能。中科院生物化學與細胞生物學研究所與中科院馬普計算生物學研究所科研人員合作研究發現環形RNA及其生成調控過程參與抗病毒免疫反應，為環形RNA的功能和抗病毒免疫相關研究提供了新的視角。相關成果在線發表於國際學術期刊《分子細胞》。

環狀RNA明星學者介紹

人物簡介

2009年畢業於美國康涅狄格大學醫學院獲生物醫學博士學位，同時獲商學院工商管理學碩士學位。同年5月作為獨立PI獲得 Connecticut Stem Cell Seed Award研究經費資助，受聘於康涅狄格大學幹細胞學院從事博士後研究，並於2010年5月任助理教授。2011年1月任上海生化與細胞所研究員。目前擔任國際期刊Trends in genetics、Genome biology、Journal of Biological Chemistry編委。曾獲全球華人生物學家協會(CBIS) 青年研究員獎、中國青年女科學家獎、亞太分子生物學聯盟 (A-IMBN) 青年研究員獎、中國遺傳協會李汝祺動物遺傳獎、中國幹細胞研究協會青年研究員獎等。

研究方向：長非編碼RNA和幹細胞

研究工作：

主要研究哺乳動物細胞中lncRNAs的功能調控，包括新類型lncRNA分子的發掘、其加工成熟機制、以及它們在轉錄、染色體、細胞核亞結構和幹細胞乾性維持等方面的調控功能研究。未來五年，我們主要研究以下內容：

1、通過轉錄組測序和計算生物學手段結合的方法，發掘和鑒定人類基因組中的新類型lncRNA分子

2、利用分子生物學、細胞生物學和生物化學的手段，研究新lncRNA分子在基因表達調控中的作用機制

3、採用基因組編輯和活細胞成像等技術手段，研究lncRNA在細胞核亞結構和染色體維持和調控過程中的功能

4、以hESCs的多功能潛能性維持和分化為模型，研究lncRNA對人源胚胎幹細胞的命運決定的調控

研究成果將能夠豐富我們對lncRNAs功能和機制的認識，也為hESCs的多功能性維持和命運改變提供一個全新水平的調控。

論文成果：

實力展示

高檔次的綜述體現理論功底

高檔次的研究論文體現科研實力

高引頻的研究論文體現論文質量

方向的原創性體現科研創新力

強大生物信息合作團隊

本文創新思路

方法學上創新

構建全新的環形RNA熒光蛋白報告基因檢測系統

1.本文使用表達系統為誘導型表達系統，由Dox誘導轉錄；

2.報告基因egfp是一個分裂的系統，中間reverted mCherry將完整的egfp分裂成2個1/2egfp；

3.質粒在Dox誘導下，當只發生常規剪切反應（Canonical splicing）時候，形成融合的fused 1/2egfp-RmCherry-1/2egf mRNA,這個mRNA翻譯既不能形成綠色熒光蛋白也不能形成紅色熒光蛋白；

4.質粒在Dox誘導下，當同時發生常規剪切反應（Canonical splicing）和反向剪切反應（back-splicing）時候，形成線性 egfp（line egf mRNA）和環狀mCherry(circmCherry),兩個mRNA翻譯後既能形成綠色熒光蛋白也能形成紅色熒光蛋白；

5.質粒在Dox誘導下，當同時發生常規剪切反應（Canonical splicing）和反向剪切反應（back-splicing）時候，形成線性 egfp（line egf mRNA）和非環狀mCherry(circmCherry),egfp翻譯後既能正常形成綠色熒光蛋白，但是非環狀的mCherry不能形成紅色熒光蛋白；

6.建立hela細胞circmCherry穩轉細胞系檢測細胞因子對於反向剪接反應的影響，本研究關注的因子是不影響egfp熒光（Cut off 0.65

7.影響因子的篩選方法使用了siRNA高通量篩選文庫：The human ON-TARGETplus (OTP) siRNA libraries

在篩選文庫中，篩選流程通過閾值過濾後主要關注RNA結合蛋白。GO分析後發現剪接和抗病毒反應居多。

什麼是siRNA高通量篩選文庫？

應用領域：

siRNA高通量干擾技術進行腫瘤新基因功能研究

siRNA方法進行腫瘤功能基因的信號轉導通路研究

基於siRNA技術規模化篩選新的腫瘤藥物靶點

基於siRNA技術規模化篩選腫瘤藥物的藥物作用靶點、增敏基因或耐受基因

篩選和開發新的siRNA腫瘤基因治療藥物

本文摘要

通過進行全基因組篩選，發現了一系列與環形RNA生成加工等密切相關的蛋白因子，其中有多個免疫反應相關蛋白，包括此前已被研究證明與抗病毒免疫相關的NF90和NF110。

在環形RNA形成時，其兩側內含子中的互補配對序列功不可沒。它們天生相互「吸引」，互補配對，推動還未成熟的環形RNA從原本線型的RNA「母體鏈條」上脫離出來並最終成環。NF90/NF110可以與內含子配對序列相結合，為它們如同正負極相吸的磁場加上一道「保險」。如果沒有這道保險，環形RNA的生成就會受到影響。

NF90/NF110也可與成熟的環形RNA直接結合形成複合物。當細胞被病毒感染時，原本位於細胞核的NF90/NF110快速轉運至細胞質，失去「保險」後環形RNA無法正常生成，從而導致細胞內成熟的環形RNA減少。而原本可以與成熟的環形RNA結合的一部分NF90/NF110重獲自由，轉而與病毒mRNA「對抗」。早在2010年，科學家們就研究發現，NF90/NF110可以與病毒mRNA結合，抑制病毒mRNA翻譯和病毒複製。環形RNA及其生成過程正是通過與NF90/NF110的協調互作，間接參與了人體的抗病毒免疫反應。

技術細節一：NF90/NF110影響環狀RNA的形成

小編大膽猜測，之所以選擇NF90和NF110作為本文亮點，有如下考慮：

一方面NF90和NF110已有文獻報道與抗病毒機制有關；

一方面NF90和NF110具有雙鏈RNA結合結構域；

另一方面，環狀RNA形成需要鹼基互補配對才能成環。由此假設，順理成章。

技術細節二：NF90/NF110通過穩定側翼內含子RNA配對促進環狀RNA形成

這裡使用了2項關鍵技術：

技術細節三：抗病毒免疫反應降低環狀RNA表達，而且NF90/NF110從細胞輸出到細胞質

poly(I:C)（聚肌苷酸胞苷酸）是一種合成的雙鏈RNA(dsRNA)類似物，是一種與病毒感染相關的分子模式。Poly(I:C)可被TLR3識別，誘導NF-kB的活化和細胞因子的產生。

一方面：當細胞加入Poly(I:C)，細胞核中NF90和NF110明顯減少，細胞質中NF90和NF110顯著增多。

一方面：當細胞加入Poly(I:C)，RIP發現pre-mRNA的數量顯著降低；

另一方面：當細胞加入Poly(I:C)，環狀RNA表達譜分析發現環狀RNA表達系統性顯著降低；

最後，過表達NF90能夠營救由於Poly(I:C)刺激circRNA表達降低而引起的表型。

技術細節四：病毒侵染讓NF90/NF110從circRNP複合物中釋放出來，從而與病毒mRNA結合

VSV病毒侵染細胞後通過NF90和NF110的RIP分析發現，VSV會顯著降低環狀RNA表達，如圖（A-D）；

通過環狀RNA和線型RNA的RNA pull Down試驗（艾博思生物RNA-pull down技術指南），環狀RNA與線性RNA相比而言，發現NF90比NF110對環狀RNA結合具有更強的偏好性。如圖E

VSVM mRNA和環狀RNA競爭性結合分析（vsvm mRNA and circRNA binding competition assay）如圖F，發現vsvm與環狀RNA結合明顯強於與線性RNA結合，而且環狀RNA的級分是NF90 RIP產物。

技術細節五：過表達環狀RNA能夠競爭NF10/NF110與病毒mRNA結合

A:構建兩種表達載體：

1#載體表達線性egfp mRNA但是無法形成circPOLR2A環狀RNA

2#載體表達線性egfp mRNA但是可以形成circPOLR2A環狀RNA

B:通過將上述1#和2#質粒轉染細胞，12h加入VSV病毒，18h收穫細胞通過FLAG-RIP發現NF90和NF110富集的vsvm mRNA丰度顯著降低

C：通過circmCherry表達載體，Dox誘導12h加入VSV病毒，18h收穫細胞通過FLAG-RIP發現NF90和NF110富集的vsvm mRNA丰度顯著降低

D：circPOLR2A過表達和circmCherry過表達以後，增強的環狀RNA表達會顯著增加病毒的複製。

與我們預測模型相符，當環狀RNA競爭性的結合NF10和NF110會使得進入細胞質中的蛋白減少，從而減弱其對病毒複製抑制作用。然而當病毒侵染細胞，環狀RNA表達降低，因此降低NF10/NF110與環狀RNA複合物cirRNP的關聯，從而允許這些蛋白與病毒的mRNA結合進行有效的宿主防禦。

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