Cell Stem Cell：鄧宏魁組小分子重編程、去分化三部曲賞析

BioArt按：2013年，鄧宏魁教授課題組率先用小分子化合物得到化學誘導的多能性幹細胞（Cheimcal-iPSCs， ciPSCs），一時間震動了整個幹細胞領域；2015年12月，該課題組又在Cell雜誌上發表封面文章，研究發現化學重編程過程中的一個類似於胚外內胚層細胞的中間態——An extraembryonic endoderm (XEN)-like state，並據此大幅提升了化學誘導的多潛能幹細胞（CiPS細胞）的誘導效率。在此基礎上，6月22日，鄧宏魁課題組和柴真課題組合作在Cell Stem Cell雜誌上發表了題為「Direct Reprogramming of Fibroblasts via a Chemically Induced XEN-like State」的研究論文，進一步將「XEN類似狀態」的研究從體細胞「重編程」擴展到了「轉分化」。此外，該研究進一步把化學誘導的「XEN類似細胞」狀態建立為一個穩定，可擴增，多功能體外細胞工具系，該工具系不僅可支持iPSC的誘導，還能「轉分化」為成為成熟的，具有功能的神經細胞 （外胚層）和肝臟細胞 （內胚層）。值得一提的是，這是繼今年4月份鄧宏魁課題組在Cell上報道了具有全能性特徵的多潛能幹細胞系（EPS細胞）之後的又一力作。

論文解讀：

人工誘導多能幹細胞（Induced Pluripotent Stem Cells，iPSs）的方法被譽為幹細胞的PCR。該方法在原理上和方法上看起來似乎很簡單：在成纖維細胞中過表達四個在胚胎幹細胞中具有重要作用的轉錄因子—Oct4，Sox2，Klf4和c-Myc —可以成功將細胞從分化狀態重編程至與胚胎幹細胞類似的多能性狀態（該項工作之前，幹細胞領域普遍認為通過幾個確定的轉錄因子逆分化成體細胞在原理和技術上都是「mission impossible」；該項工作之後，人們好奇這麼「顯而易見」的方法為什麼早沒有人想到）自從該革命性的技術問世（2006），幹細胞領域工作者為該方法的最終臨床應用不懈努力。

十餘年來， 誘導iPS的方法安全性不斷提高，從最初的插入型外源DAN （逆轉錄或慢病毒載體），非插入外源DNA （質粒，腺病毒，仙台病毒）發展到無外源DNA介入（mRNA，蛋白，小分子）（遺憾的是，在之前的探索中，安全性與高效性難以兩全—越安全的誘導方法，獲得iPS的效率越低，周期越長）。

在眾誘導方法中， 純化學（小分子）方法具有操作簡單，易改進的的優勢（比如使用組合和濃度，添加周期/時間等），應用前景廣闊（然而，至少在2013年之前，當人們描述純化學誘導的研究前景時，最常用的詞不是「目標」，而是「夢想」。當時，很多研究者對化學小分子的「微調」性質是否能當起轉錄因子般的重任有保留；再者，在重編程過程中，轉錄因子Oct4（誘導iPS的四個Yamanaka factor之一）似乎難以取代）。2013年夏，鄧宏魁教授課題組登頂成功，首次報道了用七種小分子化合物得到化學誘導的多能性幹細胞（Cheimcal-iPSCs， ciPSCs），領域震動【1】。 2009年至今，鄧教授課題組在小分子調控細胞命運領域發表了多項重要工作； 在此，本文僅從「展開系統性工作」的角度，討論該課題組在獲得ciPSCs之後的兩篇系列報道 (Cell， 2015；Cell Stem Cell, 2017)。

2015年，CiPS方法學改進和提出新機制：「A XEN-like State Bridges Somatic Cells to Pluripotency during Chemical Reprogramming」（Cell封面文章，見下圖）。

此項工作是該課題組兩年前Science工作的深入和拓展。工作主要內容包括1）優化方法：優化和細化了小分子誘導的protocol；2）新機制：發現化學誘導的細胞在重編程過程中經過了獨特的中間狀態，處於該狀態的細胞具有體外內胚層（extra-embryonic endoderm，XEN）的分子特徵和功能，被定義為XEN類似細胞（下圖）。

在化學重編程早期產生的一個上皮樣細胞的中間狀態，這一中間狀態的細胞共表達Sall4, Gata4, Gata6和Sox17等轉錄因子，在細胞的基因表達譜和體內發育能力上類似於胚外內胚層(XEN)細胞

實際上，在13年的Science文章上（下圖），作者已經發現胚外內胚層基因（ Gata4，Gata6， Gata17）和多能基因Sall4之間的相互作用對化學誘導iPSCs的形成有重要作用（在體內，Sall4 介導的去分化過程參與兩犧動物肢體再生）；更早以前，同實驗室報道了過表達Gata4和Gata6可用於誘導iPSCs。

在此項工作中，作者通過細化誘導條件，在分子水平和功能上定義了一個「XEN類似狀態」， 進一步拓展了Science工作中觀察到的幾個XEN代表性基因在誘導過程中顯著表達的結果。這個新機製為什麼重要？ iPS機制研究的基本問題之一是「路徑問題」 。越來越多的工作根據在不同時間點上對重編程過程中的細胞進行實時觀測，轉錄組測序和細胞表面標誌物檢測， 繪製了重編程過程中的高解析度分子地圖（molecular roadmap）。 目前，通過表達轉錄因子誘導iPS的過程可以大致可分為幾個比較明確的階段，各階段可以用特異性的分子標記物加以區別。簡單來說，基於轉錄因子誘導iPS的機制研究越來越偏向 「自古華山一條道」，但是基於小分子誘導iPS的轉錄分析提示通往羅馬的道路不止一條，騎馬的和坐轎的看到的風景可能不一樣。這是一個典型的由方法創新引發的理論創新。

2017年六月，XEN類似狀態的功能升級。

6月22日，鄧宏魁教授課題組與柴真課題組合作在Cell Stem Cell雜誌上在線發表了題為「Direct Reprogramming of Fibroblasts via a Chemically Induced XEN-like State」的研究論文。該工作將「XEN類似狀態」的研究從體細胞「重編程」擴展到了「轉分化」。

什麼是「轉分化」？「轉分化」一般指不同成熟細胞之間的直接轉化，這種轉化並不經過幹細胞狀態，從而可能得以避免傳統幹細胞治療（幹細胞和iPSCs細胞定向分化）中的「成瘤性」風險。 目前，實現重編程和轉分化的實驗手段主要依賴特定轉錄因子過表達。2015-16年，由小分子誘導的成體細胞轉分化方法取得重大突破，多個實驗室報道了使用不同的「小分子雞尾酒」 ，可以從人或小鼠成體細胞誘導具有功能的成熟神經細胞，心臟細胞等多種功能性細胞。 值得一提的是，2015年鄧宏魁課題組和裴鋼課題組「背靠背」在Cell Stem Cell雜誌發表文章通，報道了通過小分子化合物將成纖維細胞誘導為具有功能的神經細胞【3,4】（下圖1），這一成果還被選入封面論文（下圖2）。

1、圖片引自：Babos, K., & Ichida, J. K. (2015). Small molecules take a big step by converting fibroblasts into neurons.Cell stem cell, 17(2), 127-129.

在上小分子化合物述誘導轉分化的研究的基礎之上，鄧教授課題組進一步把化學誘導的「XEN類似細胞」狀態建立為一個穩定，可擴增，多功能體外細胞工具系，該工具系不僅可支持iPSC的誘導，還能「轉分化」為成為成熟的，具有功能的神經細胞 （外胚層）和肝臟細胞 （內胚層）（下圖）。

總結：鄧宏魁教授課題組小分子重編程、去分化三部曲是一個典型的由方法創新引發的理論創新的系統性工作。此系列工作對 如何在實驗中提煉新理論，用新理論指導新研究方向，並且通過系列工作把新理論「做大做強」提供了範式。

特別說明：2013年Science和2015年的Cell、Cell Stem Cell三篇論文中，鄧宏魁課題組的趙揚博士都是共同通訊作者或者第一作者兼通訊作者，趙揚博士現為北京大學分子醫學研究所PI。

參考文獻：

1、Hou, P., Li, Y., Zhang, X., Liu, C., Guan, J., Li, H., ... &Deng, H.(2013). Pluripotent stem cells induced from mouse somatic cells by small-molecule compounds.Science, 341(6146), 651-654.

2、Zhao, Y., Zhao, T., Guan, J., Zhang, X., Fu, Y., Ye, J., ... &Deng, H. (2015). A XEN-like state bridges somatic cells to pluripotency during chemical reprogramming.Cell, 163(7), 1678-1691.

3、Li, X., Zuo, X., Jing, J., Ma, Y., Wang, J., Liu, D., ... & Xu, J. (2015). Small-molecule-driven direct reprogramming of mouse fibroblasts into functional neurons.Cell Stem Cell, 17(2), 195-203.

4、Hu, W., Qiu, B., Guan, W., Wang, Q., Wang, M., Li, W., ... & Zhao, H. (2015). Direct conversion of normal and Alzheimer』s disease human fibroblasts into neuronal cells by small molecules.Cell Stem Cell, 17(2), 204-212.

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