從小核酸崛起到CRISPR爭議：前沿生物學離我們到底有多遠？

提到前沿生物學，很多人會覺得與我們的生活毫不相關。但實際上，前沿生物學就如同當今的「物聯網」一樣，不再是一個遙不可及的概念，而是能夠真正改變人們生活的前沿技術。

隨著國家對生物醫藥產業的重視和對基礎研究的不斷投入，中國與歐美髮達國家在生物醫學領域的差距正在逐漸縮小，尤其是在諸如小核酸製藥、CAR-T療法、CRISPR基因治療等前沿生物學領域，中國更是已經走在世界前列，「核酸製藥」、「生物醫療」等新興概念也開始越來越多地出現在人們的視野中。儘管總體上中國的生物醫學仍然落後於發達國家幾年甚至十幾年，但這股強勁的發展勢頭，已經開始為人們的生活帶來意想不到的變革。

強勢崛起的小核酸製藥

小核酸藥物是一種利用小核酸分子實現對受試者體內特定靶基因表達進行調控的基因治療藥物，其原理是利用特定的遞送方式將一段十幾到幾十個鹼基的單鏈或雙鏈小核酸分子導入組織中的靶細胞內，沉默或修飾與小核酸分子具有同源序列的靶基因表達。小核酸藥物能夠從mRNA水平上調控蛋白的形成，因此理論上能夠靶向任何感興趣的靶點。

目前主要的小核酸藥物開發平台有反義核酸平台，siRNA平台和miRNA平台等。

反義核酸平台

反義核酸平台是發展歷史最久，也是成果最多的平台。目前全球已上市和臨床在研反義核酸藥物已達38種，包括去年9月上市的杜氏肌營養不良（DMD）治療藥物Eteplirsen和12月上市的脊髓性肌萎縮（SMA）治療藥物Spinraza。Spinraza被認為是第一個重磅小核酸藥物，有望挽救數以萬計的SMA兒童患者的生命，同時為開發公司帶來數十億美元的回報。

第一個重磅反義核酸藥物——Spinraza

siRNA平台

siRNA平台是目前發展最快的小核酸製藥平台，雖然暫時還沒有相關藥物上市，但臨床上已有30多種siRNA藥物處於在研狀態，其中4種已進入臨床Ⅲ期，分別是Alnylam的Patisiran、Quark的QPI-1007和QPI-1002、以及Sylentis的SYL1001。其中，QPI-1007在國內市場由Quark與瑞博生物合作開發，這是國內第一個獲得臨床批件的小核酸藥物，而世界上第一個siRNA藥物則有望在2018年上市。

miRNA平台

miRNA平台的開發進程相對較緩，目前有8種miRNA藥物處於臨床研究階段，其中開發進展較快的是Regulus的RG-012和Roche的Miravirsen，二者目前均處於臨床Ⅱ期，miRNA平台的多靶點特性既使其在腫瘤治療領域表現出極大的發展潛力又往往是其快速推進的障礙因素。

國內方面，瑞博生物等從事小核酸藥物研發的生物公司正引領著中國的小核酸製藥行業快步向前。瑞博生物與Quark等國際合作也使得中國的小核酸製藥企業更多地走出國門，列入國際小核酸製藥行業的第一梯隊。由於種種歷史原因，國內的小核酸製藥行業主要以siRNA平台為主，反義核酸平台與國外領軍企業尚有一定差距。不過就在今年4月，瑞博生物與反義核酸製藥行業的領頭羊——美國Ionis公司簽署戰略合作協議（詳見瑞博公眾號文章：瑞博生物啟動與全球核酸製藥巨頭美國Ionis 的戰略合作），合力推動小核酸藥物在中國的研發和商業化，此舉也一定程度上彌補了國內企業在反義核酸製藥平台上的短板。

此外，崑山彭濟凱豐等專註於miRNA平台的生物公司也在著力推動著國內miRNA平台的發展進程。至此，隨著小核酸時代的來臨，這一前沿科學比歷史上任何時候都更貼近於人們的生活，關乎著人們的健康。

在爭議中前行的CRISPR

CRISPR系統是一種革命性的基因編輯技術，它通過短單鏈引導RNA（guide RNA，gRNA），基於鹼基互補配對原則靶向識別基因組或轉錄組中的目標位點，並通過Cas9、Cpf1或C2c2等具有核酸酶活性蛋白將基因組相關位點切斷並使之在基因修復中引入不同程度的缺失或插入從而改變基因的表達特徵或實現目標靶基因的編輯。CRISPR系統最經典的應用是結合CRISPR/spCas9系統用於基因敲除，後續隨著功能蛋白的不斷發現，出現了多種CRISPR系統，如Cpf1和C2c2，並且基於蛋白結構的解析，通過對其工程化改造，使得CRISPR技術得到了更廣泛的應用, 如dCas9、 fCas9、espCas9等。

目前除了DNA水平基因敲除，替換，插入等基礎編輯方式，該技術還可以用於基因表達激活與抑制，RNA編輯等基因操作。

基於CRISPR/Cas9的基因編輯技術

中國一直都走在CRISPR基因編輯技術的前沿。2013年，中科院周琦等人利用CRISPR/Cas9首次在大鼠上實現多基因同步敲除；2014年，南京大學黃行許等人利用CRISPR/Cas9首次在非人靈長類中實現定向基因突變；2016年10月，四川大學華西醫院腫瘤學家盧鈾教授領導的團隊，將CRISPR基因編輯的T細胞注入了轉移性非小細胞肺癌患者體內，實現了CRISPR技術的首次臨床應用。國外方面，美國國立衛生研究院（NIH）也已經批准了賓夕法尼亞大學的CRISPR人體試驗計劃，該研究可能於今年晚些時候啟動。

此外，Editas Medicine，Intellia Therapeutics，CRISPR Therapeutics，Casebia Therapeutics等專註於CRISPR基因編輯技術的生物公司也在籌劃啟動相關的臨床試驗，但目前尚未得到NIH的批准。

領導首例人體CRISPR臨床實驗的四川大學華西醫院腫瘤學家盧鈾教授

不過就在今年5月30日，Nature Methods上的一篇通信文章卻再一次將CRISPR推到了風口浪尖，使得飽受倫理爭議的前沿技術再次面臨拖把效應的挑戰。該研究工作指出，目前廣泛使用的基因編輯技術CRISPR/Cas9可能存在嚴重的脫靶效應，能夠導致小鼠體內產生大量的非預期脫靶突變，包括上百種插入缺失突變和上千種點突變。如果這一研究結果被證實，無疑將會給CRISPR技術的臨床應用造成難以估量的負面影響。

該研究在採用CRISPR-Cas9技術成功地修復小鼠胚胎中一種導致失明的Pde6b基因突變後，進一步通過全基因組測序發現兩隻實驗鼠中都存在脫靶效應造成的非預期基因突變，其中一隻小鼠（F03）出現了164個插入或缺失突變和1736個點突變，另一隻小鼠（F05）則出現了128個插入或缺失突變和1696個點突變。更加嚴重的是，採用現行的預測方法預測的前50個潛在脫靶位點在實際檢測中無一出現，表明目前的脫靶預測方法存在很大的弊端。

Nature Methods公布的CRISPR系統脫靶數據

此文一出，業內一片嘩然，儘管CRISPR系統可能存在脫靶效應是學術界的共識，但在以往的研究中，的確很少有研究者使用全基因組測序來評估CRISPR的脫靶效應，也從未認為其脫靶效應有可能如此嚴重。

該文章一經發表後，學術界就出現了不同的聲音，除了大量公眾號的轉載和評論外，比較多的是來自業界人士的質疑，其主要爭議在於該文的實驗數據不足、對照組設計不合理等。比如Xiaoli Wu就在Pubmed上發表了一封措辭強硬的comment，嚴重質疑該研究實驗設計的合理性和數據的準確性（目前該comment已刪除）；而主攻CRISPR基因編輯的生物醫藥公司Editas Medicine也迅速發文反駁這一結果，其首席技術官Vic E. Myer與著名科學家Gorge M Church聯合發文，稱該研究的實驗設計和數據解釋不足以支撐作者得出的結論（這一文章目前刊登在Church實驗室網站上）。

除此之外，也有研究人員開始試圖探究造成CRISPR大範圍脫靶的作用機制和應對措施，比如有研究者通過同源性分析推測可能有某些序列和二級結構與gRNA骨架相似的非編碼RNA充當了「內源gRNA」的角色，從而引起大範圍脫靶。

目前，全球範圍內至少已有幾十個課題組表示計劃或已經開展了該研究類似的脫靶驗證工作，相信真相很快就會水落石出。

Editas Medicine的首席CTO與Church的聯合發文

小核酸與CRISPR的脫靶

歷史總是驚人的相似，小核酸在發展歷史上也受到過脫靶效應的質疑。從原理上講，小核酸與CRISPR具有一定的相似之處，他們都需要一段與靶基因互補的短序列和一個執行切割作用的酶或酶複合物。小核酸中與靶基因互補的序列長度通常為16-30 nt（主要為16-23nt），而CRISPR的gRNA中，除去通用骨架部分的gRNA scaffold，負責與靶基因鹼基互補的guide sequence序列通常為20nt。兩者用於互補配對的鹼基長度相似，因此可能具有相似的脫靶現象。

CRISPR系統的gRNA結構

然而由於作用機制的不同，小核酸藥物的目標只是將靶基因的表達量敲低，在發生脫靶時，鹼基的錯配會使得脫靶基因的IC50比靶向基因的IC50高數倍甚至數個量級，因此可能不會對脫靶基因造成嚴重的影響，並且小核酸藥物的基因敲低效應通常是可以逆轉的，在停葯後一般能夠恢復。

更主要的是，隨著近年來小核酸產業對技術平台的整體改進，以及序列設計，遞送方法，化學修飾和藥物活性上的優化，脫靶效應已基本可以避免，不再是制約小核酸產業發展的瓶頸了。

對於CRISPR系統而言，由於它是直接將目標靶基因進行插入、缺失或者點突變，且一旦發生難以逆轉，所以在技術應用，尤其是臨床應用時需要非常謹慎的判斷其潛在的脫靶效應，因為脫靶一旦發生，很有可能會帶來災難性的後果。

不過需要指出的是，目前臨床（前）研究中採用的CRISPR技術一般是充分考慮過脫靶問題的，比如通過篩選更優的gRNA，改良Cas9蛋白以提高特異性，使用更低的Cas9和gRNA濃度來降低脫靶效應等。

此外，我國正在進行的，和美國即將進行的CRISPR臨床試驗都不是直接在受試者體內應用CRISPR系統，而是將受試者的T細胞取出，在體外用CRISPR/Cas9系統敲除PD-1基因後，通過相關安全性評價，再重新導入患者體內，這也在很大程度上削弱了脫靶效應帶來的潛在風險。

因此，筆者對CRISPR的臨床應用前景仍然保持審慎的樂觀，畢竟，任何基於事實的質疑都有其獨特的價值，而每一次爭議最終都會促進技術的進步和完善。

小核酸製藥已經開啟了一個新的時代，而CRISPR的大規模臨床應用似乎也不再那麼遙遠，如今的前沿生物學正越來越多的走出實驗室，為守護人們的生命和健康帶來革命性的力量。「21世紀是生物的世紀」這個承諾了近一代人的夢想似乎終於要走進現實了。

參考材料：

2. Schaefer, K. A., et al. (2017). "Unexpected mutations after CRISPR-Cas9 editing in vivo." Nat Methods 14(6): 547-548.

3. http://arep.med.harvard.edu/pdf/Schaefer_Opinion_2Jun2017.pdf

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