冷凍電鏡幫助揭示動力蛋白持續「行走」激活機制｜前沿

動力蛋白（灰色）通過高爾基囊泡接頭蛋白BICD2（橙色）與動力蛋白激活蛋白（彩色）結合的複合物結構模型。來源：http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/groups/cartera/main.html）

撰文 | 吳 槑

責編 | 陳曉雪

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在生物體內的真核胞內的微觀環境中，有一些被稱作「細胞骨架」的網狀結構就如同城市中四通八達的軌道交通。分子馬達

（molecular motor）

是一類驅動細胞自身或細胞內部的物質運動的大分子複合物。 其中有一類非常重要的骨架依賴的分子馬達，被稱為馬達蛋白

（motorprotein）

，就是沿著細胞內部密集分布但卻井然有序的細胞骨架，運輸重要的生命貨物，充當著細胞裡面的交通工具。

這些過程必須嚴格遵守細胞內的「交通規則」，就像現代的物流系統一樣，必須在特定的時間和特定的地點把適量的貨物精確運輸到另外一些地點，否則整個細胞的「微型社會」就會徹底紊亂。成千上萬的馬達蛋白分子就是在這些規則的約束下，在如同密密麻麻的複雜網路軌道上穿梭前行，而又有條不紊，為細胞內的物質運輸提供了重要分子基礎。

動力蛋白

（dynein）

是一類沿著微管做負向運輸的馬達蛋白

(Carter 2013, Bhabha, Johnson et al. 2016)

，早在半個世紀以前就被發現

(Gibbons 1963)

。但是因其超大的分子量和高度的構象動態特性，一直是公認的難以解析的「硬骨頭」。雖然經過世界各地幾代科學家多年探索，迄今為止，人們甚至對完整的動力蛋白極低解析度的三維輪廓圖都難以獲取。其在細胞內以怎樣的方式的自抑制？又是怎樣被完全激活？這些問題所涉及到的精細的分子機制就更加然迷霧重重。

最近，利用冷凍電鏡

（cryo-electronmicroscopy, cryo-EM）

單顆粒重構技術，英國MRC分子生物學實驗室

（MRC-LMB）

的Andrew Carter實驗室解析了人源動力蛋白phi-顆粒

（phi-particle）

狀態的結構，並與其德國合作者證明phi-顆粒代表了動力蛋白在細胞質中的自抑制狀態。同時該實驗室也獲得了難度更大的具有37個不同大小亞基的DDB三元複合物中等解析度結構，結合一系列生物化學和生物物理實驗系統而全面地揭示了動力蛋白如何從自抑制狀態轉化為激活狀態的兩重精細調控機制，動力蛋白由此具有了長距離運輸物質的能力。

6月8日，《細胞》

（Cell）

在線發表了這一結果。論文上線當天，筆者聯繫到了Andrew實驗室的博士後研究員，本篇論文的第一作者張凱博士，聽聽一線科學家講述動力蛋白背後的研究「動力」究竟源於何處。

《知識分子》：

馬達蛋白在生物體內是起到運輸作用的重要執行者，一直是細胞生物學和結構生物學研究的熱點。其中，動力蛋白的結構研究更是因為其難度極高而引人矚目。你們是如何開始動力蛋白的研究的？

張凱：

動力蛋白是一類骨架依賴的分子馬達，通常沿著微管做負向運輸，在生命體的基本活動，比如細胞分裂中的紡錘體形成和染色體排列、細胞極性、胚胎髮育、神經系統中的囊泡運輸、線粒體和高爾基體等細胞器的分布、蛋白質

（包括變性聚集蛋白質）

和mRNA等生物大分子的定位、細胞內吞作用、病毒侵染等等過程中，都起到了非常重要的作用。

動力蛋白分子量巨大、構象複雜，相比其它骨架依賴的馬達蛋白，如驅動蛋白

（kinesin，和動力蛋白相反，主要沿著微管做正向運輸，少數例外）

，分子量要大將近一個數量級

(Carter 2013)

。而且，動力蛋白高度動態可變，之前的生化和功能研究

(McKenney,Huynh et al. 2014, Schlager, Hoang et al. 2014)

已經發現動力蛋白在未結合動力蛋白激活因子時是處於自抑制的構象，不能在微管上作長程運輸；只有和其激活因子、接頭蛋白，比如BICD2N形成三元複合物

（簡稱為DDB複合物）

，才處於完全激活的狀態。Seeing is believing

（眼見為實）

。如果能從高解析度結構層次上直接「看到」動力蛋白高度複雜的調控機制，這將是非常有意義的一件事。我們這項工作正是以此為出發點，試圖解釋動力蛋白如何自抑制以及如何被激活的精細的分子機制。

《知識分子》

：

面對如此巨大而又複雜的大分子機器，你們在研究過程中有遇到實驗或數據處理方面的困難和挑戰嗎？又是怎麼解決的？

張凱

：

了解冷凍電鏡的研究人員都很清楚，取向優勢是電鏡三維重構的一個瓶頸。我們解析的自抑制狀態下的動力蛋白呈現長棒狀，稱為phi-顆粒

（phi-particle）(Amos 1989)

。Phi-顆粒在玻璃態的冰層中有著嚴重的取向優勢，很難「站立起來」，也沒有「斜著的」，只有「平躺的」；而平躺的也只有典型的兩個方向，其餘都是零星分布。此外， phi-顆粒在濃度稍高時就相互疊加，阻礙後續重構，一張照片實際可用顆粒僅十個左右。我們嘗試了各種優化取向的辦法，比如換緩衝液、拉pH值和鹽濃度梯度、添加氨基酸或各種去垢劑等、不同性質的載網在不同條件下親水處理等各種可能的條件相互組合，都沒有明顯改善，或者取向雖然解決了但卻引入其它更嚴重的問題，總共篩過的電鏡樣品就接近兩千個。最後我們決定硬著頭皮收集大量電鏡照片，不算上面提到的激活態的DDB複合物，光phi-顆粒的照片就有上萬張，有大量都是手動完成。

MRC-LMB電鏡機時異常緊張，一般情況兩三個月才輪一天，我們不得不花費很大精力寫申請書尋找外源機時，這導致收集的數據成像條件都不一致，對後續的數據處理造成相當大的麻煩。幸好經過多方努力，我們最後還是獲得了足夠的數據。

處理數據時也遇到了一些困難。動力蛋白具有高度動態特性，呈現極為複雜的多級多尺度構象變換，如同動態彈性網路一樣，這種動態特性完全有別於我們簡單認為的多個結構域之間的相對剛體運動。如果只是簡單的多剛體運動

（multibody movement）

，就像幾個鋼球組裝起來相互旋轉移動，這似乎沒有任何難度，我們很容易通過一些計算技巧解決。Phi-顆粒狀態已經算是動力蛋白最穩定的狀態了，但多級多尺度動態特性依舊極其嚴重，經過多輪多級分類，通過優化局部分類和取向，分別處理動力蛋白的「尾巴」和「馬達」兩部分，我們才完成了最後的結構解析。但這項工作並沒有因此結束，更加複雜的開口狀態，目前我們還沒有辦法直接獲得三維結構，現在只是做一些簡單的多級二維聚類分析。

《知識分子

》: 在新發表的Cell文章中，你們使用了大量的生化和細胞實驗來驗證基於結構和前人實驗提出的動力蛋白的自抑制和激活模型，解釋了為什麼動力蛋白需要動力蛋白激活因子來協助其運動。能夠簡單解釋一下動力蛋白激活的具體過程是什麼樣的？

張凱：

此前的研究表明，動力蛋白單獨在體外實驗和細胞質中都存在自抑制現象

(Splinter, Razafsky et al. 2012, McKenney, Huynh et al. 2014,Schlager, Hoang et al. 2014, Torisawa, Ichikawa et al. 2014)

，也就是說它並不能沿著微管做持續的長距離運輸。我們的結構和生化試驗已經充分證明了phi-顆粒作為動力蛋白的自抑制狀態而普遍存在，但這些試驗都是體外的證據；我們德國的合作者通過在體細胞實驗，關鍵性地證明了phi-顆粒的存在對於動力蛋白在細胞內的功能至關重要。開始我們認為，可能只要通過突變體打開phi-顆粒二聚化界面，就能激活動力蛋白。結果有點出乎我們的意料之外，事實上野生型和突變體動力蛋白都必須通過動力蛋白激活因子和BICD的結合才能被完全激活。為了進一步研究清楚這些細節，我們進一步解析了難度更大的三元複合物DDB。我們分析和比較了不同狀態的動力蛋白結構，一個關鍵性的因素就是動力蛋白的尾部結合到其激活因子核心部分平行排列的短纖維結構，這個過程迫使尾部必須順應這種平行排列的構象；最終這種巨大的構象變化影響了馬達結構域的空間取向分布，從而使其能夠沿著平行的微管軌道做持續的單向運輸。

《知識分子》

:

冷凍電鏡技術發展驚人，可以說在過去幾年引發了結構生物學領域內的革命。你對冷凍電鏡技術未來發展動向有什麼期待或預測？

張

凱：

得益於直接電子探測設備和電鏡數據處理演算法上的改進，冷凍電鏡技術在過去幾年發生了革命性的變化，其中一個關鍵性事件就是UCSF華人學者程亦凡教授實驗組與其合作者首次解析了3.3埃解析度的TRPV1結構

(Liao, Cao et al. 2013)

。目前能夠解析的蛋白質的分子量下限和解析度不斷被突破，其重要性已經不言而喻，幾乎在各個尺度上已經全面取代了晶體學。至於冷凍電鏡還不能完成的更小尺度的蛋白分子，似乎已經沒有太多生物學意義了，因為冷凍電鏡技術的目標應該是朝著更大更複雜，而不是更小的生物體系去發展。這只是我個人的一個觀點。

未來，如何解析高度動態的蛋白質超大複合物在原子尺度完整的功能循環，讓靜態的結構變成動態的高清電影，看清楚它們在原子層次上動態機理將是冷凍電鏡技術發展的一個重要方向。這和動力學模擬有本質區別，因為它將是實實在在的實驗結果，意義不言而喻。

另外，冷凍電子斷層掃描技術

(cryo-electrontomography)

也在不斷發展，如果在未來能夠大幅提高解析度，對於我們理解更大尺度上的細胞器亞結構信息將產生不可估量的深遠影響。因為這項技術涉及的對象不僅限於傳統的離體蛋白複合物，而且可以是真正具有「生命意義」的對象，並且能夠在化學甚至物理層次上還原生命物質的結構基礎。這些方面的研究可能遠遠超出生物學自身的範疇，必然是一個多學科高度融合交叉的寶藏地帶。如果一旦實現亞細胞層面的原子解析度結構解析的常規化，必然伴隨著大量聞所未聞、見所未見的新的生命現象和規律的爆炸式發現，最終從基本的物質層次上解讀複雜生命體或許指日可待。

參考文獻:

Amos, L.A. (1989). "Brain dynein crossbridges microtubules into bundles." JCell Sci 93 ( Pt 1): 19-28.

Bhabha,G., G. T. Johnson, et al. (2016). "How Dynein Moves AlongMicrotubules." Trends Biochem Sci 41(1): 94-105.

Carter, A.P. (2013). "Crystal clear insights into how the dynein motor moves." JCell Sci 126(Pt 3): 705-713.

Gibbons,I. R. (1963). "Studies on the Protein Components of Cilia from TetrahymenaPyriformis." Proc Natl Acad Sci U S A 50: 1002-1010.

Liao, M.,E. Cao, et al. (2013). "Structure of the TRPV1 ion channel determined byelectron cryo-microscopy." Nature 504(7478): 107-112.

McKenney,R. J., W. Huynh, et al. (2014). "Activation of cytoplasmic dynein motilityby dynactin-cargo adapter complexes." Science 345(6194): 337-341.

Schlager,M. A., H. T. Hoang, et al. (2014). "In vitro reconstitution of a highlyprocessive recombinant human dynein complex." EMBO J 33(17): 1855-1868.

Splinter,D., D. S. Razafsky, et al. (2012). "BICD2, dynactin, and LIS1 cooperate inregulating dynein recruitment to cellular structures." Molecularbiology of the cell 23(21):4226-4241.

Torisawa,T., M. Ichikawa, et al. (2014). "Autoinhibition and cooperative activationmechanisms of cytoplasmic dynein." Nature cell biology 16(11): 1118-1124.

Urnavicius, L.*, K. Zhang*, et al.(2015). "The structure of the dynactin complex and its interaction with dynein."Science 347(6229): 1441-1446.

K. Zhang*, H.E. Foster* et al. (2017).「Cryo-EM Reveals How Human Cytoplasmic Dynein IsAuto-inhibited and Activated.」Cell, http://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(17)30585-8

製版編輯：斯嘉麗

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