腦脊液miRNA在中樞神經系統退行性疾病中的應用研究進展

本文原載於《中華神經外科雜誌》2016年第12期

微小RNA(microRNA，miRNA)是真核生物細胞的一類長度為22個核苷酸左右的非編碼小RNA，廣泛存在於人體所有組織和體液如血液、尿液、唾液、乳汁和腦脊液中[1]。體液中miRNA常與蛋白質等構成複合物形式存在，抵抗RNA酶降解，具有高度的穩定性和保守性，在機體的病理生理過程中發揮關鍵性調控作用[2]。在健康個體之間miRNA表達譜較一致，但在不同的疾病狀態下表達譜可發生顯著的變化，這種表達譜的變化往往早於生化及影像學的改變，是理想的疾病早期診斷潛在標誌物[3,4]。隨著對miRNA認識的進一步深入和miRNA功能分析技術的優化，miRNA在各種生理過程中扮演的角色得到深入闡釋，各種疾病miRNA表達譜的改變也逐步得到重視。前期學者們主要集中研究血漿中miRNA在疾病中的應用，由於血腦屏障的存在，中樞特異性的miRNA進入血液受到限制，近年來腦脊液中miRNA在中樞神經系統疾病中的作用機制的研究正逐漸得到重視。

一、腦脊液是中樞疾病潛在標誌物miRNA的理想來源

隨著對miRNA研究的深入，發現miRNA的表達存在細胞或者組織特異性，即在不同的細胞或組織中存在著不同的miRNA，或者miRNA含量不同[5]。如miR－17、miR－18、miR－19和miR－20位於同一基因簇內，在斑馬魚細胞中表達，但在鼠腎和蛙卵巢細胞中不表達；miR－122在成年肝臟特異性高表達，而miR－124則在腦組織中表達量最高[5]。中樞神經系統疾病患者病變在中樞、腦和脊髓組織是miRNA最特異性的標本來源。但腦與脊髓取材不易、風險高、不可行。腦脊液直接與中樞相連，位於腦室、蛛網膜下腔和脊髓中央管內，參與腦和脊髓的物質代謝，中樞神經系統發生病變時，miRNA可從病變組織釋放入腦脊液。因此，腦脊液中可存在大量腦和脊髓組織來源的miRNA，腦脊液miRNA表達譜的改變能充分反映中樞的病變情況。其次，由於血腦屏障的存在，腦脊液中所含蛋白的成分比血液等簡單得多，miRNA檢測的干擾因素相對較少，能更好篩選標誌物，便於重複和統一[6]。更重要的是腰椎穿刺抽取腦脊液檢查是中樞疾病診斷治療的重要輔助手段之一，取材方便、可行，較腦組織活體組織檢查(活檢)創傷性小，容易在臨床推廣。因此腦脊液是中樞疾病診斷標誌物miRNA檢測的理想來源。

二、miRNA的用機制及功能

miRNA是一種具有調控功能的非編碼RNA，其本身不能翻譯成蛋白質，主要通過鹼基互補配對原則與靶基因mRNA的3′端非翻譯區結合，在轉錄後水平負向調控其靶基因的表達活性，參與生命活動中一系列重要生理病理過程。可通過三種作用方式實現：一是和靶mRNA通過不完全互補配對而抑制靶mRNA翻譯，這種模式不會影響靶mRNA的穩定性；二是與靶mRNA完全互補配對結合，特異性切割靶mRNA，作用方式和功能與小干擾RNA相似，從而引起靶mRNA的降解，減少其表達；三是同時具有以上兩種作用方式，當與靶mRNA完全互補配對時，直接靶向切割mRNA發揮作用，當與靶mRNA不完全互補配對時，起抑制靶基因mRNA翻譯的作用[7]。

miRNA對機體具有廣泛的調控作用，單個miRNA可調控成百上千的靶基因。生物信息學預測，人類基因組大約30%～92%的基因受到miRNA的調控[8]。中樞神經系統中miRNA的分布廣泛，可調節不同部位及不同發育階段神經細胞的增殖、分化與凋亡，是中樞神經系統結構和功能調控網路中不可或缺的重要分子，並對人類的認知和記憶能力的形成起重要作用[9]。miRNA在病理條件下的異常表達(表達上調或下調)會影響其所調控靶基因的功能，導致中樞神經系統正常的結構和功能失調，表現為各種中樞神經系統疾病。

三、miRNA與中樞神經系統退行性疾病的關係

神經退行性疾病是由腦和脊髓中神經元結構或功能損傷所引起的，隨著年齡增長而不斷惡化[10]。神經退行性疾病病理過程十分複雜，原因也多種多樣。近年來研究發現，miRNAs與神經退行性疾病的發生髮展有著密切關係。

1．阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease, AD)：

AD是一種持續性的神經功能障礙，其主要的病理特徵是腦組織中β澱粉樣蛋白(Aβ)沉積和過度磷酸化的微管蛋白(tau)異常聚集。這兩種蛋白是AD主要病理標誌性蛋白，對該病具有重要診斷價值，但只有77.2%的AD患者腦脊液表達疾病相關的Aβ或tau蛋白，靠此診斷方法一定程度上增加了漏診率[11,12]。越來越多的研究表明，異常表達的miRNA與AD的發生髮展有著密切關係。

澱粉樣前體蛋白β位分解酶1(BACE1)是AD病理通路中β澱粉樣蛋白生成的關鍵酶，而該酶又受到miR－29a的調節。已有研究發現AD患者腦脊液中miR－29a表達水平較對照組增高2.2倍，升高的miR－29a可上調BACE1的活性誘導Aβ蛋白的生成，導致腦組織中Aβ過度沉積，形成AD的特有病理標誌[13]。鑒於miR－29a對Aβ蛋白生成的調節作用，推測腦脊液中miRNA檢測很可能成為AD診斷的一種潛在生物標誌物或治療靶標。Muller等[14]已經證實了腦脊液miR－29a的診斷價值，其診斷AD的敏感度為89%、特異度為70%。Galimberti等[1]也發現AD患者腦脊液中miR－26b表達量較對照組明顯降低，miR－26b作為生物標誌物診斷AD的敏感度達到78%、特異度達到60%；進一步研究發現，miR－26b表達下調增加了tau蛋白的磷酸化，促進AD的發生髮展[14,15]。也有研究通過miRNA晶元和實時熒光定量PCR兩種方法同時證實AD患者腦脊液中具有特異性miRNA表達譜，miR－125b在AD患者腦脊液中表達較健康對照組明顯上調，差異具有統計學意義[16]。最重要的是，病理狀態下miRNA表達譜變化早於生化及其他影像學的改變，對AD的早期診斷具有特殊意義。例如在AD最早期僅有輕微認知障礙時，尚不能檢測到Aβ相應變化，此時腦脊液中miR－9、miR－125b、miR－146b和miR－155即表現為明顯的表達上調，提示miRNA對AD具有早期診斷價值[17]。此外，在疾病的鑒別診斷方面，miRNA也表現出較高的應用價值。近期一項薈萃分析表明，單用腦脊液Aβ和tau蛋白鑒別診斷AD和其他類型的痴呆(血管性痴呆、額顳葉痴呆和路易體痴呆)具有局限性，診斷的敏感度(70%～75%)和特異度(65%～80%)均較低[18,19]。但利用miR－29c－3p/miR－15a－5p的比值鑒別診斷這兩類疾病可達到較高的效能，當臨界值為0.92時，鑒別診斷的敏感度達到90%，特異度達到100%[20]。綜上所述，深入研究AD患者腦脊液中miRNA表達譜的改變將有助於闡明miRNA在AD發病中的作用，能夠為AD的診斷治療提供新的策略，具有廣闊的應用前景。

2.帕金森病(Parkinson′s disease)：

帕金森病是一種以黑質紋狀體通路退變為主要特徵的神經退行性疾病。其病理學基礎是中腦黑質緻密部多巴胺能神經元變性或進行性減少，其後殘存的神經元胞質內有嗜酸性包涵體(Lewy小體)的存在，和α－突觸核蛋白異常堆積，使多巴胺生物合成能力降低，從而導致紋狀體區多巴胺缺乏而致病[21]。研究表明，miRNA參與了多巴胺能神經元的增殖、凋亡、分化等過程，與帕金森病的發生髮展有關[21]。

已有研究表明帕金森病患者腦脊液miRNA表達譜較健康對照明顯不同，其中17種miRNA的表達水平在兩者之間存在明顯的差異，提示miRNA對帕金森病具有一定的診斷潛能[22]。富亮氨酸重複激酶2(leucine rich repeat kinase 2, LRRK2)對神經元生長、發育和變性發揮重要作用，其表達過剩或過度活化均可導致神經退行性疾病，是部分家族性帕金森病和散發性帕金森病的直接原因[23]。正常情況下，miRNA－205可與LRRK2基因的3′非翻譯區結合來抑制LRRK2蛋白的表達，使機體處於穩定狀態，但帕金森病患者腦組織中miRNA－205表達明顯下調，對LRRK2蛋白表達的抑制作用減弱，最終LRRK2的表達過剩導致帕金森病的發生[21,24]。成纖維細胞生長因子20(fibroblast growth factor 20, FGF20)作為miRNA－433的靶基因之一，可正調控α－突觸核蛋白的表達，導致該蛋白異常蓄積，是帕金森病發病機制中重要的一部分。研究發現帕金森病患者腦脊液中miRNA－433表達明顯下調，與其靶基因FGF20結合後對FGF20蛋白表達的抑制作用減弱，FGF20過表達後導致α－突觸核蛋白異常蓄積，促進帕金森病的發生髮展[21,22]。因此，miRNA在帕金森病的發病機制中具有重要的作用，可能為以後的基因靶向治療提供新的治療靶點，具有潛在的臨床應用價值。

3.肌萎縮性側索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)：

ALS是一種以選擇性侵犯腦與脊髓的上、下運動神經元的神經系統變性疾病，主要表現為全身肌無力、肌肉萎縮和進行性肢體癱瘓，多數患者將在出現臨床癥狀後3～5年內死於呼吸肌麻痹[25]。對ALS患者早期用藥可緩解疾病進展，但該病起病隱匿，早期癥狀不典型，易導致誤診，平均誤診時間達1年[26]。因此尋找客觀、準確的早期診斷標誌物對減少誤診和提高預後至關重要。

Campos－Melo等[27]發現ALS患者脊髓組織中miRNA表達譜發生變化，進一步分析發現這些差異表達的miRNA與神經細胞死亡密切相關，提示miRNA對ALS的發生髮展具有調節作用。近期一項大樣本研究發現，散發性ALS患者白細胞、血清、腦脊液和脊髓組織中miR－338－3p的表達量均明顯增高，可作為散發性ALS早期診斷的生物標誌物[28]。其他miRNA的表達變化，如腦脊液中miR－27b、miR－146a和miR－532－3p的表達上調，不僅在ALS的早期診斷中顯示出較高的臨床應用價值，而且在ALS與多發性硬化的鑒別診斷中發揮重要作用[2]。因此，腦脊液中miRNA與ALS的發生髮展密切相關，值得進一步研究。

4.其他神經退行性疾病：

亨廷頓病(Huntington′s disease)是臨床常見的神經退行性疾病之一，是由於亨廷頓蛋白髮生CAG三核苷酸重複序列擴展突變引起的一種惡性常染色體顯性遺傳疾病。研究發現，在亨廷頓病小鼠腦組織(miR－124a)、亨廷頓病患者血液(miR－10b－5p、miR－196a－5p、miR－196b－5p、miR－615－3p和miR －1247－5p)及亨廷頓病患者腦皮質(miR－132、miR－9)中多種miRNA參與了亨廷頓病的發生及發展[29,30]。脊髓小腦型共濟失調(spinocerebellar ataxia，SCA)也是一種常染色體顯性遺傳的神經退行性疾病。目前，在SCA動物模型、人類細胞系及SCA人類血液中已經鑒定了一些直接靶向SCA疾病相關基因的miRNA(miR－19a、miR－101和miR－130)[31]。其次顳葉痴呆(frontotemporal lobar degeneration)是早發性神經退行性痴呆的常見原因之一，已經發現miR－659結合位點上的遺傳多態性與顳葉痴呆的發病風險密切相關[31]。但無論在亨廷頓病、SCA還是顳葉痴呆患者腦脊液中miRNA變化情況目前還未見相關報道。因此人類腦脊液中miRNA是否和如何調節這三種神經退行性疾病的病理過程仍有待進一步研究。

四、總結和展望

隨著研究的日益深入，越來越多的疾病有關的miRNA被發現，同時這些miRNA的生物學功能及靶基因逐步得到闡釋，使從基因水平對疾病的發生髮展過程進行調控成為可能，為臨床提供了極具價值的潛在治療靶點。目前，用於丙型肝炎治療的miR－122靶向治療藥物miravirsen已進入Ⅱa期臨床試驗階段，並顯示出良好的安全性和有效性[32]。但目前有關中樞神經系統miRNA的研究才剛剛起步，後續仍需大量研究探索miRNA的變化原因和調節機制，以及它們在中樞各疾病間的作用，以期早日將miRNA應用於臨床中樞神經系統疾病的特異性診斷和個體化靶向治療。

參考文獻略

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