Menin增強c-Myc介導的轉錄

Nat Commun.2017May 5;8:15278. doi: 10.1038/ncomms15278.

Menin enhances c-Myc-mediated transcription to promote cancer progression.

標題：Menin增強c-Myc介導的轉錄促進癌症增殖

摘要：Menin是一種神秘的顯示獨特的能力蛋白質,或抑制或促進腫瘤發生以條件相關方式。Menin促致癌功能很大程度上歸因於其形成H3K4me3介導MLL甲基轉移酶複合體重要作用,。在此,我們確定一個意想不到的角色Menin在增強致癌基因MYC反式活性以H3K4me3獨立的方式。有趣的是,我們發現Menin與MYC TAD域直接交互，共定位於MYC的E-Box增強MYC靶基因的轉錄以P-TEFb依賴方式。我們進一步證明,在體外和體內實驗，通過轉錄增強癌細胞MYC靶基因的表達,Menin刺激細胞增殖和細胞代謝。我們的研究結果發現了之前從未發現的機制：作為致癌基因調節因子Menin對MYC介導基因轉錄至關重要。

引言

原癌基因C-Myc (以下稱為MYC)是一個重要的癌蛋白，其表達失調與人類30 - 50%惡性腫瘤有關。在正常或病理條件下，作為轉錄因子, MYC通過調節眾多靶基因對細胞增殖,細胞凋亡、分化、新陳代謝、體細胞重編程和其他關鍵過程至關重要。眾所周知,MYC調節多達15%的人類基因,主要是通過結合到標準E-box域促進轉錄。有趣的是,最近的研究顯示,而不是調節轉錄的基因集,失調的MYC放大現存活化基因的表達以條件相關的方式,置MYC於主調節基因在新的研究中。最近,兩組提供新的證據表明致癌基因MYC選擇性地調節基因促進細胞生長和腫瘤進展。因此，對於MYC如何在正常或病理情況下調控基因轉錄，尤其是在腫瘤發生時，使它仍是一個活躍的研究領域。Menin蛋白是一種神秘的蛋白質在癌症發展的新角色最近吸引了很多關注。Menin顯示了其獨特的能力,抑制內分泌系統腫瘤發生或促進肝臟和造血系統致癌功能。然而，它作用的分子機制還沒有明確的定義。

Menin最初確定為多發性內分泌瘤基因1型(MEN1)編碼的主要核蛋白質,其種系基因突變導致內分泌胰腺腫瘤,垂體瘤和甲狀腺瘤。有趣的是,Menin蛋白細胞腫瘤抑制作用是細胞類型特定的,例如:破壞在肝臟或血液系統Menin不會導致腫瘤。相比之下,Menin蛋白異常表達在肝細胞癌(HCC)促進肝腫瘤發生部分通過調節Yes相關蛋白的表達(Yap1)18,意味著自相矛盾的腫瘤抑制基因致癌作用。有人建議,Menin促癌作用至少部分地對混合種系白血病(MLL)基因產物MLL1 MLL2起著一個重要的致癌輔助因子,這些基因是SET包含域組蛋白甲基轉移酶(HMTs),介導組蛋白H3賴氨酸4三甲基(H3K4me3)。觀察到H3K4me3主要是在轉錄活性位點,鏈接轉錄初始化。然而,新證據表明Menin轉錄調節作用獨立於MLL甲基轉移酶複合體。正如上面提到的證據表明,MYC和Menin的多方面的調節功能是條件相關的,我們推斷,闡明這些條件相關的調節對理解這兩個蛋白質在腫瘤發生的作用很關鍵。顯然,大家知道,MYC與MAX和其他輔助因子結合形成調節複雜體在E-Box啟動基因轉錄,顯而易見,這MYC介導過程仍需要依賴其他尚未確定關鍵因子。有趣的是,我們早期的分析顯示一個廣泛MYC和Menin調節基因重疊。這些早期的觀察提示我們解決Menin是否及如何涉及腫瘤發生在MYC失調的情況下。在此我們報到Menin通過P-TEFb在MYC介導轉錄活化中起著重要的作用,表明Menin是一個MYC腫瘤形成的潛在幫凶。我們的研究表明,在異常表達這些癌基因癌細胞，聯合靶向MYC和Menin信號可能作為有效的治療策略。

結果：

Menin上調MYC靶基因的表達

MYC是增殖細胞轉錄主調節基因。全基因組分析研究表明,Menin也在轉錄調節發揮著廣泛的作用。為調查MYC和Menin調節基因表達之間是否有任何相關性,我們比較分析了人類基因纖維肉瘤HT1080細胞有沒有MYC或Menin。我們RNA-seq數據顯示MYC調節3176個基因而Menin調節1984個基因。其中,1084個基因同時受MYC和Menin調節,占MYC基因總數的34.13%和Menin的54.64%,分別突出高度重疊MYC和Menin調節網路。細胞周期相關基因以及許多代謝相關基因是受MYC調節最常見基因, Menin的情況類似,進一步表明MYC和Menin之間的密切相關性。

Menin是一個MLL HMT複合體非甲基轉換酶組件,協調H3K4me3,通常與基因轉錄初始化相關。除了Menin,H3K4me3 HMT複合體還有其他三個保守三甲基轉換酶因子,ASH2L,WDR5 RBBP5。我們的研究結果證實, HT1080細胞Menin過表達實際上增強了H3K4me3修飾，而敲除Menin就降低H3K4me3修飾。這表明Menin增強MYC靶基因的轉錄獨立於H3K4me3 HMT複合體的整合。

Menin結合E-box通過與MYC交互

雖然Menin蛋白被認為是調節H3K4me3修飾一個關鍵因子,以前的研究也報道稱,Menin具有與H3K4me3無關的功能。我們的研究結果表明,H3K4me3沒有涉及Menin介導MYC的靶基因上調。鑒於事實Menin調節大量MYC靶基因和Menin沒有直接調節MYC本身的表達,我們假設Menin可能直接參与MYC介導轉錄過程以H3K4me3的獨立方式。為解決我們的假設,我們首先執行HEK293T細胞免疫沉澱反應實驗共轉染HA-MYC和Menin標記，發現Menin與MYC存在交互。其他實驗也類似。接下來,我們繼續確定MYC哪些域和Menin交互。MYC蛋白包含幾個主要的高度保守的功能區域,包括反式激活域(TAD),中央部分域(CP)和基本helix-loop-helix亮氨酸拉鏈域(bHLHZ)。利用截斷MYC媒介表達MYC不同功能域,我們的研究結果表明,Menin與TAD域交互,表明Menin可能上調MYC靶基因通過結合到MYC TAD域和增強MYC基因轉錄活化。

作為一個基本helix-loop-helix轉錄因子,MYC和MAX形成異質二聚體結合於靶基因啟動子區域E-box序列。由於Menin結合到MYC的TAD域和Menin提升MYC靶基因的表達,我們接下來研究Menin是否與MAX或甚至E-box序列的交互直接影響MYC介導基因的轉錄。不同與MYC與MAX二聚化,Menin沒有直接與MAX的關係。E-box被發現直接與MYC / MAX異質二聚體以及MAX / MAX同源二聚體交互。有趣的是,Menin結合到E-box序列只有在同時存在MYC和MAX的情況下,這表明Menin結合到標準MYC靶基因E-box序列以一種MYC和MAX介導的方式。總的來說,我們的研究結果表明,Menin提升MYC靶基因表達通過MYC結合E-box序列。

Menin和MYC定位染色質

因為我們的結果表明,Menin通過MYC結合到E-box,我們執行ChIP-seq分析MYC和Menin結合序列，以解決Menin是否和MYC在染色質共享一些共同的結合位點。有趣的是,MYC和Menin蛋白的結合位點的分析顯示,87.07%(7065/8114)的MYC結合基因序列也與Menin相關。基序增強分析啟動子序列顯示MYC和Menin結合位點一致E-box序列明顯的富集。進一步分析MYC和Menin的染色質結合位點分布顯示高度相似模式,確認MYC和Menin實際上共定位於染色質。然而, H3K4me3在染色質結合位點的分布模式顯然是不同於MYC和Menin。

這些高通量測序數據的進一步分析表明,MYC和Menin共結合基因涉及嘌呤代謝(PPAT PAICS),細胞生物合成(NPM1),細胞代謝(SCD1 BCAT1)等等。基因跟蹤分析還表明,MYC和Menin都結合到SCD1 NPM1,BCAT1,PPAT PAICS基因。MYC和Menin都結合到SCD1,NPM1 BCAT1的E-box，從而確認MYC和Menin共定位染色質。MYC對Menin占居E-box序列是必須的。值得注意的是, HT1080細胞Menin敲除沒有影響MYC結合E-box序列。

Menin促進MYC和P-TEFb交互

Menin結合到E-box序列通過MYC TAD域;然而,Menin抑制不影響MYC在E-box序列定位。因此,我們接下來研究Menin調節MYC反式激活。我們調查Menin是否影響招募P-TEFb複合體在MYC調節轉錄期間。P-TEFb是細胞周期蛋白的異質二聚體,由細胞周期蛋白T1(CycT1)和細胞周期蛋白依賴性激酶CDK9組成。數據表明,Menin直接與MYC和P-TEFb複合體交互。Menin包含一個深口袋,可分為四個不同的領域,包括NTD(N端結構域), Thumb拇指, Palm手掌和Finger手指域。MYC強結合手指域但弱結合N端結構域和手掌域，而P-TEFb複合體特異性與手指域交互。Menin對MYC和P-TEFb之間的交互所需。Menin通過P-TEFb增強MYC活性。P-TEFb主要是磷酸化RNA聚合酶II c端域(CTD)的第二個絲氨酸(Ser2)殘留,增強伸長的過程。數據顯示, RNA聚合酶II-CTD磷酸化Ser2(Ser2-P)增加,但不是Ser5磷酸化(Ser5-P)是因Menin蛋白過表達,這表明Menin蛋白涉及了RNA聚合酶II介導伸長。Menin通過P-TEFb激活RNA聚合酶II。flavopiridol(FP)，一個CDK9激酶抑制劑有效地阻止Ser2-P RNA聚合酶II-CTD水平。當HT1080細胞Menin被抑制,招募CDK9到MYC靶基因明顯減弱，所以MYC靶基因招募CDK9和Ser2-p RNA聚合酶II，Menin是必須的。Menin促進MYC和P-TEFb之間的交互刺激MYC靶基因的RNA聚合酶II伸長。此外,FP治療抑制CDK9明顯Menin增強的MYC靶基因表達在mRNA和蛋白水平，表明CDK9活化對Menin增強的MYC靶基因表達很關鍵。敲除CDK9或CycT1明顯抑制MYC靶基因表達在mRNA和蛋白水平。一致地,抑制CDK9 shrna廢除了Menin蛋白對MYC靶基因表達的增強效果,進一步確認P-TEFb對Menin增強MYC靶基因表達很關鍵。總的來說,我們的數據表明,Menin增強MYC介導轉錄通過刺激通過P-TEFb RNA聚合酶II。

Menin促進MYC介導癌症新陳代謝和生長

Menin影響大量MYC靶基因的表達,如細胞周期CDK4,糖酵解LDHA HK2和脂類代謝SCD1。MYC大多數癌症細胞中高度表達,包括HT1080細胞。過表達Menin促HT1080細胞細胞增殖;然而,當MYC被抑制對細胞增殖的影響也消除,這表明通過Menin增強MYC細胞增殖。或Menin通過MYC促進了細胞增殖。MYC基因涉及調節許多代謝酶,如癌症細胞糖酵解LDHA和HK2。我們的研究結果表明,LDHA和HK2也受Menin調節。HT1080細胞MYC基礎水平高,過表達Menin增加細胞的糖酵解的細胞外酸化率(ECAR)和葡萄糖攝取和乳酸產生,表明Menin增強癌症細胞糖酵解代謝。然而,當MYC被抑制,Menin對糖酵解的影響也被廢除,這表明Menin增強的糖酵解是MYC介導的。此外,Menin敲除明顯降低HT1080細胞糖酵解。SCD1,是一種脂質合成和脂肪存儲的關鍵酶，一個MYC靶基因也被Menin調節,。抑制SCD1損傷P493-6細胞和HT1080細胞增殖，抑制脂質合成與降低細胞甘油三酯(TG)水平和降低HT1080細胞脂質積累。而MYC敲除導致細胞降低TG水平，確認MYC調節脂質代謝。此外, Menin強力表達增加細胞TG水平，表明MYC介導Menin調節脂質代謝。Menin通過MYC調節癌細胞的新陳代謝。老鼠模型Menin強力表達明顯加速體內腫瘤生長。為確定Menin是否與人類惡性腫瘤有關,我們使用人類肝癌臨床樣本,發現與相鄰正常組織Meninm RNA和蛋白水平高表達在HCC中,暗示Menin表達與臨床肝癌存在強相關性。總的來說,我們的數據表明,Menin增強MYC的轉錄過程促癌症進展。

喜歡這篇文章嗎？立刻分享出去讓更多人知道吧！