藥物研究過程中「後天」雜質的引入與避免

作者：庄濤

背景介紹

雜質研究在藥物質量研究中的重要性毋庸置疑，直接與藥物的三大基本要素「安全、有效、可控」息息相關。筆者根據自身在藥物雜質分離、純化與結構解析方面的工作經歷，將藥物研發過程中遇到的雜質從另外一個角度(來源方面)分為「先天」雜質與「後天」雜質兩種：將樣品中本身含有的雜質稱為「先天」雜質(樣品中固有的雜質)，而從天平稱量樣品、稀釋劑溶解定容樣品、通過注射器與微孔濾膜過濾樣品、將樣品轉移至液相進樣小瓶，以及樣品最後與流動相接觸經過色譜柱到達檢測器這些過程中產生的雜質為「後天」雜質(液相人工產物)詳見Fig.1。這些「後天」雜質的出現最直接的後果是會讓我們對樣品的含量與穩定性產生一定的誤判，使我們的檢測結果喪失準確性，嚴重的甚至會阻礙項目的順利展開。

本文將主要從我們實驗過程中可能產生「後天」雜質的三個主要環節(配樣、液相進樣小瓶和樣品進入色譜柱)著手，結合一些比較經典的案例與大家交流一下藥物研究過程中「後天」雜質引入的原因以及如何避免使其產生。

Fig.1.可能引入「後天」雜質的環節

每個環節經典案例分享

1.樣品配製過程中「後天」雜質的引入

樣品溶液在放置過程中不穩定從而產生降解雜質，是我們在實驗過程較為常見的問題，也是這裡所說的引入「後天」雜質最常見的情況之一。關於這方面的例子也比較多，因此在這裡就不一一舉例。在這部分想和大家分享：Dapoxetine暴露在空氣中發生降解、光照催化Oxcarbazepine降解、金屬離子催化Olanzapine降解這三個例子。

1.1 Dapoxetine暴露在空氣中發生Cope消除產生的「後天」雜質(Semmelweis University)

樣品外觀的變化：András[1]等發現Dapoxetine鹼基暴露在空氣中保存一段時間後樣品由原本的無色油狀物變為棕黃色，同時TLC檢測發現有降解雜質出現，其中一個為主要的降解雜質。

降解雜質的結構鑒定：首先通過硅膠柱對其進行純化，後利用LC-MS，1D-NMR，2D-NMR等波譜手段確定其結構為1- (2E)-cinnamyloxynaphthalene，另外一個次要的降解雜質結構鑒定為1-(2Z)-cinnamyloxynaphthalene (Fig.2)，二者為一對異構體

Fig.2.Dapoxetine及其降解物的結構

降解機理推測：

(1)Hofmann消除反應還是Cope消除反應：胺類化合物的消除反應主要可以分為Hofmann消除反應與Cope消除反應。但是由於經典的Hofmann消除反應需要先將胺類化合物與碘甲烷反應生成季銨鹽，然後在氧化銀作用下(加熱)通過E2消除最後生成烯烴與胺，由於其條件的苛刻性，因而排除了Dapoxetine通過Hofmann消除反應產生1- (2E)-cinnamyloxynaphthalene的可能。與此同時Cope消除反應是通過叔胺的氮氧化物發生立體選擇性消除生成烯烴與羥基胺，且該反應條件溫和在室溫下即可發生，因而推測Dapoxetine主要通過該機理髮生降解；

(2)機理的驗證：作者首先通過mCPBA將Dapoxetine氧化為Dapoxetine-N-oxide，室溫下放置幾天後，用1H-NMR檢測發現樣品中的確有1-(2E)-cinnamyloxynaphthalene生成，進而驗證了該講解反應機理的可能性(Fig.3)。

Fig.3.Dapoxetine降解產生1-(2E)-cinnamyloxynaphthalene的機理

1.2 光照催化Oxcarbazepine產生的「後天」雜質(Breckenridge Pharmaceutical)

問題的發現：陳洪等[2]在研究首仿葯Oxcarbazepine的期間發現主峰前面有一個未知雜質(RT 2.7min，>0.2 %)且峰面積有時大有時小(Fig.4)。

Fig.4.Oxcarbazepine的色譜圖

未知雜質的結構鑒定：

(1)穩定性：通過Flash collector收集該未知雜質餾分時發現其在酸性條件下穩定，在鹼性條件下會進一步降解為其他的雜質。

(2)後經MS，NMR數據推測該雜質的結構如Fig.5所示，將Oxcarbazepine結構中羰基的鄰位CH2也氧化為羰基，形成鄰二酮的結構。

Fig.5.Oxcarbazepine及其未知雜質的結構

未知雜質出現的原因：

(1)確認是否為「後天」降解雜質：在實驗期間發現同樣的樣品，保存在桌面上的樣品顏色變深，保存在冰箱中的樣品顏色沒有變化。進一步經HPLC檢測發現，保存在冰箱中的樣品無該未知雜質的峰，而保存在桌面上的樣品中該未知雜質的含量為1.27%，因而推測該雜質實際為一個「後天」降解雜質，可能受到光或溫度的影響。

(2)誘導因素：經過進一步的考察發現，該未知雜質是在光照的作用下降解產生的，光照24h，48h該未知雜質的含量可分別達到0.38%、0.97%，避光保存的樣品中無該雜質出現(Table 1)。

Table 1 光照對Oxcarbazepine中未知雜質(RT 2.7min)含量的影響

1.3 銅離子催化Olanzapine產生的降解雜質(Lilly Research Laboratories)

問題的發現：據Steven[3]等報道Olanzapine的原料葯及其與Fluoxetine的復方製劑樣品在不同實驗室的檢測結果(含有SDS的離子對色譜條件)中偶爾會出現一個未知雜質峰，其含量有時會超過Olanzapine峰面積的0.1%，因而可能會對產品的質量檢測結果產生較大的干擾。由於這個未知雜質是偶發的出現，因此推測其並非為樣品中固有的雜質峰，而是一個「後天」雜質。

Fig.6.Olanzapine-fluoxetine復方膠囊在離子對條件下的液相色譜圖(含有未知雜質，乙腈-SDS緩衝鹽體系)

可能原因的初步推測：後發現使用不鏽鋼管路的液相的檢測結果中未知雜質1的含量最高，而且換成peek管路後這個未知雜質的含量會降低，因而推測是微量的金屬催化產生的該「後天」雜質。

推測的原因的驗證：通過將Olanzapine與9種較為常見的金屬元素分別混合，在原有的稀釋劑(乙腈/水=1:1)體系下模擬反應(Fig.7)。結果表明Olanzapine在Cu的催化下會產生相同的未知雜質1與2；同時發現將稀釋劑中的乙腈/水替換為甲醇/水後未有降解雜質的產生。因而，根據上面的實驗結果初步推測這兩個「後天」產生的降解雜質是Olanzapine在二價銅離子與乙腈的同時作用下催化產生的。

Fig.7.Olanzapine中產生「後天」雜質的原因驗證

未知雜質的結構鑒定：通過FT-ICR MS，UV，PHPLC，NMR等手段最終鑒定未知雜質1為一價銅離子(Cu+)，未知雜質2為Olanzapine結構中噻吩環上甲基氧化羥甲基的氧化產物，詳見下圖(Fig.8)。備註：由於是在離子對的色譜條件下，所以一價銅離子(Cu+)在色譜柱上會有保留，而不是在死體積處出峰。

Fig.8.Olanzapine與硫酸銅反應後的反應液

降解機理的推測：根據Cu2+催化Olanzapine反應的過程中樣品溶液的顏色會發生較大的變化，結合文獻推測降解過程中有氮自由基陽離子過渡態出現，綜上分析可能的降解機理為Olanzapine在Cu2+與乙腈的同時作用下首先生成Olanzapine氮自由基陽離子，同時Cu2+被還原為Cu+(未知雜質1)，Olanzapine氮自由基陽離子會進一步在空氣中氧氣的作用下生成hydroxy-olanzapine(未知雜質2)，詳見Fig.9。

Fig.9.二價銅離子與乙腈催化Olanzapine發生降解的機理推測

如何避免該「後天」雜質的產生：文章作者通過驗證發現，當配樣的樣品體系中Cu2+的含量超過100 ppb的時候，降解產生的未知雜質1 (Cu+)的含量即可達到Olanzapine峰面積的0.1%。

預防措施：(1)根據Cu2+的來源-經過對試驗用試劑，流動相用水，液相系統中Cu2+的含量測定後發現(ICP-OES)，洗瓶機用水中的Cu2+的含量可高達820 ng/ml.(2)在樣品配置過程中加入金屬離子絡合劑EDTA，提前將樣品溶液中的Cu2+絡合起來，從而避免降解反應的發生；(3)也可交以將稀釋劑中的乙腈替換為甲醇。當然我們在實際的操作中也可以將多種措施結合起來。

2.液相進樣小瓶與玻璃儀器接觸產生的「後天」雜質

2.1 進樣小瓶介導的Berry pseudorotation (Merck Research Laboratories)

研究背景：液相玻璃進樣小瓶在每個分析實驗都很常見，現在不同品牌的生產廠家也很多，通常我們認為進樣小瓶是惰性的，不會對樣品的穩定性產生影響，而且在開發驗證方法時不會考慮不同品牌的液相進樣小瓶對檢測結果的影響，但是Rebecca[4]等在研究抗丙肝藥物Sofosbuvir的中間體(1，結構見Fig.10)時發現，同一份樣品溶液，兩種不同的保存過程a)在液相進樣小瓶中放置24h；b)在容量瓶中放置24h，結果發現樣品a中會產生一個新的降解雜質(0.1%，Fig.10)，而b樣品無新的降解雜質出現，從而引發了作者對「不同品牌液相進樣小瓶對該樣品穩定性的影響」問題進行了思考。

Fig.10.Sofosbuvir中間體-Cmpd1的結構及其乙腈溶液放置24h後的色譜圖

a)在液相進樣小瓶中放置24h；b)在容量瓶中放置24h

降解雜質的結構解析：通過1D，2D-NMR以及購買合成的對照品比對二者的出峰時間，最終確定該降解雜質的結構為Sofosbuvir中間體1的差向異構體-P的手性中心構型發生了變化(2，結構見Fig.10)。

產生降解雜質的原因排查：

(1)液相進樣小瓶的影響：選取3個不同廠家製造的5批玻璃液相進樣小瓶(A，B-C， D-E)以及聚丙烯塑料內插管分別分裝同一份樣品，並隨著時間變化考察降解雜質Cmpd 2的含量變化趨勢。結果表明分裝在聚丙烯塑料內插管中的樣品中未有Cmpd 2的產生，而3個不同廠家製造的玻璃液相進樣小瓶中分裝的樣品中Cmpd 2含量差異比較大，放置一個星期後Cmpd 2的含量從1%-29%不等，其中以B廠家的進樣小瓶降解程度最大29%(Fig.11)。從而可以判斷Cmpd 2是樣品乙腈溶液與玻璃進樣小瓶接觸後產生的「後天」雜質。

Fig.11.不同廠家製造的玻璃液相進樣小瓶(A，B-C，D-E)以及聚丙烯塑料內插管隨時間變化對Cmpd 2含量的影響

(2)玻璃滲出物還是玻璃本身：為了進一步判斷是否是玻璃進樣小瓶中的滲出物促使降解物Cmpd 2的生成，作者設計了Fig.12所示的實驗方案：將乙腈分裝至B廠家的進樣小瓶中，保存19天後，將乙腈取出繼續用於溶解Cmpd 1配樣，HPLC檢測結果表明無降解雜質2的生成；同時將乙腈浸潤後的進樣小瓶再次用於配樣，HPLC仍然檢測到降解雜質2的生成，但是降解程度比最初實驗中觀察到的要低，提示玻璃中的部分reactive components被浸潤到乙腈中。因而可以推測：並非是玻璃進樣小瓶中的滲出物直接促使降解物Cmpd 2的生成，同時玻璃本身在降解過程中起到關鍵的作用。

(3)滲出物pH值的變化：結合文獻中報道的含有P原子的手性中心構型翻轉的實驗條件，推測如果本實驗中液相進樣小瓶滲出物的pH值會增加(變鹼性)，則會使得降解雜質Cmpd 2的生成變得更為合理，因而作者進一步驗證了上面提到的3個不同廠家製造的玻璃液相進樣小瓶(A，B-C，D-E)中水浸潤一段時間後水溶液pH的變化，結果如Table 2所示，pH的增加程度與Fig.11中的降解雜質Cmpd 2的含量趨勢一致；

Fig.12.排查降解產物是玻璃滲出物還是玻璃本身的作用

Table 2.不同廠家的玻璃液相進樣小瓶(A-E)中水浸潤後pH的變化

降解機理的推測：

(1)驗證鹼性對降解雜質Cmpd 2的促進作用：HPLC檢測結果發現向樣品中添加三乙胺後會馬上生成降解雜質Cmpd 2，20h後Cmpd 2的含量可達到37.6%；與此同時將三乙胺替換為鹼性更強的二異丙基胺後，相同的時間點下比添加三乙胺樣品中降解程度較弱，說明降解過程除了與鹼性相關外，鹼的空間位阻大小也會對降解程度有影響；

(2)降解機理(Berry pseudorotation)：鹼性條件下，鹼會進攻Cmpd 1中的磷原子，生成一個三角雙錐體，然後經過Berry pseudorotation使的P原子處的手性中心發生翻轉，從而生成「後天」雜質Cmpd 2 (Fig.13)。

Fig.13.「後天」雜質Cmpd 2可能的生成機理

如何避免該「後天」雜質的產生：結合該降解反應的影響因素及其可能形成機理，推測可行的預防措施如下：(1)由於該降解反應需要在鹼性環境下進行，因而可以在配樣過程中加入少量的酸來避免降解反應的進行。

3.在色譜柱上發生的降解反應

3.1 Oxycodone-「後天」雜質的引入導致峰前沿(Purdue Research Center)

研究背景：作者展開研究的時候現有的針對Oxycodone的分析方法多含有離子對試劑，但是離子對試劑的使用使的色譜柱損害的比較快，因而Kevin[5]等試圖開發一種不含有離子對試劑的分析方法，經過摸索後開發的方法流動相條件為MeOH-0.05 M KH2PO4 (pH 3.0)，0.5% MTBE，0.1% TEA，但是在方法開發的過程中遇到峰前沿很嚴重的情況，因而對峰前沿的原因展開調查。

柱溫對峰形的影響：作者發現改變柱溫會對色譜圖中峰的數目、Oxycodone的峰形產生較大的影響，在0℃，30℃，60℃三個不同的柱溫條件下，主峰的拖尾因子會由30℃時的0.7增加到60℃時的0.95，而且60℃時峰形變好後，原本被包裹在主峰中的兩個工藝雜質峰也被首次檢測到，與此相反0℃時主峰的前面會多出兩個未知雜質峰(Fig.14)。

未知雜質峰的結構鑒定與機理推測：基於上面觀察到的不同柱溫條件下色譜圖之間的差異，推測0℃時主峰的前面會多出的兩個未知雜質峰為Oxycodone烯醇異構化產物。(1)通過觀察氘代Oxycodone-d3在酸性條件甲醇溶液中的穩定性，室溫下放置一星期後，但是質譜檢測結果顯示Oxycodone-d3在中的氘原子沒有被交換掉(Fig.15)；(2)同時經過質譜檢測發現0℃時主峰的前面會多出的兩個未知雜質峰分別為Oxycodone與水、甲醇形成的半縮酮(Fig.15)。經過上述分析可以推測Oxycodone在柱溫30℃時的峰前沿現象是由於Oxycodone與流動相中含有的水、甲醇形成溶劑加合物(動態的平衡)造成的。

Fig.14.Oxycodone在不同溫度下的色譜圖

Fig.15.Oxycodone與流動相接觸產生的"後天"雜質

3.2 Litronesib-胺類化合物的亞硝基化(Lilly Research Laboratories)

研究背景：色譜技術的快速發展促使了耐酸鹼(耐受寬pH值範圍)色譜柱的出現，從而使得廣大的分析工作人員在方法開發時有了更多的選擇，特別是含有脂肪胺結構片段的樣品時，因為這一類的樣品在大於pKa的色譜條件下會有較好的峰形以及分離度。David[6]等在開發針對Litronesib(含有脂肪胺結構)的分析方法時就開發了一個高pH值流動相的色譜方法(Waters X-Bridge C18，0.18% 氨水-水(pH 11)：乙腈)。但是在該條件下經常在主峰的後面檢測到一對未知雜質(Fig.16)，且不同的色譜柱檢測結果表明這兩個雜質的含量相差很大，因而作者針對這個問題展開了研究。

Fig.16.Litronesib在高pH值流動相下的色譜圖以及兩個未知雜質的UV吸收圖

未知雜質的結構解析：(1)紫外吸收曲線：這兩個雜質的紫外吸收曲線相同，且與Litronesib的紫外吸收極為類似，表明Litronesib結構中的主要發色團1，3，4-thiadiazoline未發生變化。(2)通過高分辨質譜確認這兩個未知雜質為同分異構體，其分子式比Litronesib多NO少1H，因而初步推測這兩個未知雜質的可能結構為Litronesib中的仲胺發生了亞硝基化(Fig.17)。(3)通過對推測的結構進行定向合成，經對比發現在HPLC，LC-MS中與樣品中的兩個未知雜質出峰時間一致。

Fig.17.Litronesib主峰後兩個未知雜質的結構

驗證是否是「後天」引入雜質：

(1)樣品配製：將樣品稀釋液由原本的流動相(高pH值)替換為中性或酸性溶液後，未知雜質峰消失；然而新配置的溶液中也會出現這兩個未知雜質峰，因而可以排除這兩個未知雜質是樣品與稀釋液反應生成的(Fig.18)；

(2)酸性流動相下的HPLC/LC-MS檢測結果：將流動相pH值調整為酸性後，LC-MS檢測結果發現未觀察到這兩個未知雜質峰對應的離子峰。因而可以推測這兩個未知雜質為高pH值條件下在色譜上降解產生的雜質峰。

(3)其他廠家的色譜柱：將原本的Waters X-Bridge C18色譜柱替換為Phenomenex Gemini C18、Waters Xterra MS C18以及Waters Acquity CSH C18，結果發現在上述色譜柱中均會發生上文提到的降解反應。

Fig.18.驗證是否為「後天」引入的降解雜質

發生降解反應原因：

(1)Litronesib發生亞硝基化的氮元素的來源：經過如Fig. 19所示的驗證方案，結果表明氨水是亞硝基化氮的來源，同時乙腈也是降解反應發生需要的因素。

(2)Griessassay測試表明流動相排出液中含有NOx的存在，因而根據上述實驗的結果可以將該降解反應表示如Fig.19所示，Litronesib與氧氣、氨水、乙腈在色譜柱上發生了亞硝基化的產應，從產生了這兩個後天降解雜質。

(3)其他影響因素: 通過進一步的考察發現，在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃等不同的柱溫條件下，溫度越低降解雜質含量越大；改變有機相的比例，樣品在色譜柱上的保留時間越長降解雜質含量越高。

(4)其他含有胺的樣品：結果表明包括Paroxatine、Setraline、Clozapine等在內其他六種結構中含有胺的樣品，在該高pH值色譜條件下均會發生類似的亞硝基化降解反應。

(5)柱篩板以及進樣次數對降解反應的影響：一根新的Waters X-Bridge色譜第一針進樣時亞硝基化降解雜質含量最低，隨著連續進樣次數的增加，亞硝基化雜質的含量會慢慢增加，當連續進樣10針之後，亞硝基化雜質的含量趨於穩定；同時作者還考察了柱篩板對降解反應的影響，結果如Fig.20所示，因而可以推測柱篩板也參與到亞硝基化的降解反應中。

Fig.19.Litronesib發生亞硝基化的氮元素的來源驗證

Fig.20.柱篩板對降解反應的影響

可能的降解機理：經總結分析後推測，含有胺類結構片段的化合物在色譜柱上發生亞硝基化降解反應的可能機理如Fig.21所示，乙腈、氧氣、氨水等首先反應生成三氧化二氮，三氧化二氮與Litronesib在柱篩板上進一步發生亞硝基化反應。

Fig.21.Litronesib發生亞硝基化的可能反應機理

可能的避免措施：結合該降解反應的影響因素及其可能形成機理，推測可行的預防措施如下：(1)將氨水替換為碳酸氫銨，去掉亞硝基化氮的來源；(2)嘗試將樣品稀釋液以及流動相中的乙腈替換為甲醇。

總結與討論

除此之外，容量瓶或者液相進樣小瓶未清洗乾淨、儀器方面的殘留產生的干擾峰也是上面提到的引入「後天」雜質途徑的一種，但是這種情況相對比較容易排查，因此在這裡未進行進一步展開論述。通過上述的案例分析，不難發現「後天」雜質的引入現象在我們實驗過程普遍存在，而且有些「後天」雜質頗為「神秘」。希望通過這篇小結能夠起到拋磚引入的作用，引起大家對「後天雜質引入」問題的思考，揭開這些「後天」雜質(HPLC人工產物)的神秘面紗。

備註：由於個人水平有限，書寫過程中如有不足之處請大家批評指正，這篇小結僅供拋磚引玉之用，也希望能與各位同行共同交流、共同進步！

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