CRISPR基因編輯技術是「魔剪」還是「亂箭」？——專訪賽業生物科技副總裁歐陽應斌博士

最近，相信很多人都關注到了關於「魔剪」CRISPR引發大規模「意外」脫靶效應的新聞。一篇發表在《自然》子刊Nature Methods上的論文給這一生命科學領域的「大明星」帶了不小的負面新聞。

藉助全基因組測序，研究人員發現，這一革命性的基因組編輯技術能夠引入數百種意想不到的突變到基因組中。探索君也在第一時間對這篇論文進行了報道。

具體來說，該研究中，科學家們對先前經受過CRISPR基因編輯的小鼠進行了全基因組測序。結果發現，兩隻接受了基因治療的小鼠的基因組中存在超過1500個單核苷酸突變以及超過100處更大片段的缺失和插入。需要強調的是，這些DNA突變都沒有被計算機演算法預測出來。

論文共同作者稱，沒有使用全基因組測序來尋找脫靶效應的研究人員可能會錯過潛在的重要突變。即使是一個單個核苷酸變化也會產生巨大的影響。

這篇論文的發表引發了不小的轟動。那麼，究竟這是不是一篇值得「恐慌」的論文？CRISPR技術的應用是否會受到很大的影響？近日，記者採訪了賽業生物科技技術副總裁、高級科學家歐陽應斌博士。他說：「目前，CRISPR臨床應用的安全性是完全不具備的，我們必須投入巨大的資源去把脫靶的真正原因找出來，並設計出有效對策。」

以下是採訪實錄：

記者：能否請您先介紹一下這一備受矚目的基因組編輯技術的由來？

歐陽博士：20年前，日本科學家石野良純在克隆一個目的基因時偶然發現一種特別的重複序列；隨後10年，研究人員一直在試圖破解這種存在於很多細菌和古細菌的神秘序列，並給它冠以CRISPR這麼個古怪的名稱。CRISPR的「神秘面紗」直到10年前才開始被逐步揭開。原來它是一種以病毒DNA序列為精準打擊對象的「導彈防禦系統」。

近幾年，以MIT張鋒實驗室為首的科學家小組把這種進化論產生的生物「武器」用在了各個物種的基因改造上，包括果蠅、斑馬魚、老鼠、猴子等。這一便捷高效的基因組編輯工具成為了生命科學研究中前所未有的「利器」。我們甚至可以利用這把「利器」來糾正人類的基因缺陷。一些致力於利用CRISPR技術治療疾病的公司很快誕生了。目前，已有多家這類公司在美國上市。

記者：據了解，脫靶效應是CRISPR系統一直存著的問題。為什麼此次Nature Methods上的這篇論文會引起這麼大的「反應」？

歐陽博士：一直以來，關於CRISPR脫靶效應的文章就層出不窮。一些文章稱，應該重視脫靶效應，但也有文章稱，其實脫靶效應危害不大，是可控的。此外，張鋒博士還提供了預測脫靶效應的免費「神器」。

之所以這篇論文反響會如此大，是因為這次發現的問題徹底顛覆了之前大家對CRISPR脫靶效應的普遍看法。最突出的問題是，之前大家關注的脫靶主要是插入/缺失突變indel（insertion & deletion），而這次發現最多的脫靶卻是點突變SNV（single-nucleotide variant）。每隻鼠有大約1700個點突變加上100多個indel。更匪夷所思的是，這些SNV和indel發生的位置都不在預測出來的脫靶位點上。

記者：您剛剛也提到，之前有很多關於CRISPR脫靶效應的文章。為什麼，只有這篇文章才發現「大量點突變」的問題？

歐陽博士：這個我也感到很不可思議。我的猜測是，大家一直沒有往這個方向想，而且之前的測序深度不夠，沒有找到更可靠的技術發現點突變。研究者的關注點都集中在預測出來的脫靶位點可能發生的indel。這次用的是50X的深度測序，而且關注點沒有局限於脫靶位點和indel，而是拓展到全基因組的各種突變，問題就顯現出來了。

記者：這篇文章發表後，也有很多人發出質疑聲。他們認為，之所以出現如此大規模的脫靶，可能是gRNA的設計有問題。您怎麼看？

歐陽博士：gRNA的設計確實直接影響脫靶，但不管這次的gRNA是如何設計的，我們之前的預測「神器」完全失靈了。預測出來的前50個脫靶位點沒有一個發生脫靶。我們原來的認識是：脫靶風險是與gRNA和基因組相關位置之間的同源程度成正比的，這一次我們完全沒有看到這種關係。這彷彿是要逼我們重新回到原點，重新審視脫靶的機理，原來的認識可能完全是錯誤的。

記者：這篇文章是在小鼠上用CRISPR技術做基因突變，暴露了其嚴重的脫靶效應，但即使如此，我們是不是仍然可以通過一些辦法來區分我們設計的基因突變與脫靶突變，繼續用CRISPR在小鼠上做基因功能研究？

歐陽博士：脫靶突變給小鼠模型帶來的最大問題是我們不知道一個模型的表現型是我們設計的定點基因突變造成的還是我們不知道的某一個脫靶突變造成的。原則上來說，有兩種傳統辦法可以幫助解決這個問題：一個是通過與野生鼠交配去除模型鼠中的脫靶突變，只剩下我們設計的基因突變；另一個是針對同一個模型多做幾個line的鼠，看它們的表現型是不是一致的，如果一致，那這表現型就比較可能是我們設計的突變造成的。不幸的是，這篇文章的數據告訴我們，這兩種傳統辦法都無法解決CRISPR脫靶突變的問題。

單說這1700個點突變和100多個indel，分布在每條染色體上平均有好幾十個。通過與野生鼠交配去除這些突變是很困難的，因為每一代交配發生在每一條染色體上的同源重組平均也就不到一次，即使把這個突變數降低一個數量級，通過幾代的交配來去除，仍然是非常困難的。

更要命的是，這篇文章發現，分別在兩個line的老鼠上的這大約1700個點突變和100多個indel大部分都是相同的，所以通過多拿到幾個line的小鼠並得到相同的表現型來說明該表現型來自我們設計的基因突變而非脫靶突變是難以成立的。因為不同line的脫靶突變很可能也是一樣的。當然深度的二代測序可以告訴我們脫靶的「真相」，但太貴、太耗時了，也不能去除脫靶突變。

記者：那用CRISPR做小鼠的基因突變還可行嗎？

歐陽博士：與傳統的ES細胞基因打靶技術製備基因工程小鼠相比，CRISPR技術的最大優點是快捷和低成本。但如果脫靶的問題不能解決的話，用該方法來製備基因工程小鼠顯然遠遠沒有ES基因打靶可靠，尤其是像條件性基因敲除（cKO）這樣複雜昂貴的項目，實在不建議用CRISPR，因為不用花多得太多的代價和時間，完全可以用ES打靶這個久經考驗的金標準。我們兩年前推出的TurboKnockout技術平台，在傳統ES基因打靶上引入了兩項重大技術革新，進一步壓縮了ES打靶的周期和成本，是加大了這個金標準的優勢。我們的人工智慧設計網站更是簡化了方案的設計，我們的技術完全可以彌補CRISPR的不足。

記者：這篇論文似乎是給CRISPR技術潑了盆冷水。您如何看待這一技術在醫療領域的應用前景？

歐陽博士：至少在醫療領域我看不到近期內的應用前景。目前CRISPR臨床應用的安全性是完全不具備的，我們必須投入巨大的資源去把脫靶的真正原因找出來，並設計出有效對策。但我相信，這項技術在科研上仍然不失為一個有用的工具。下一步我們必須找出問題，解決問題。

關於歐陽應斌博士

歐陽應斌（Marvin Ouyang）於1997年開始就職於美國Oklahoma醫學研究基金會，擔任高級科學家，成功發現、純化並克隆了兩種硫蛋白轉移酶，成功建成基因敲除小鼠模型。2002年擔任美國Thios生物製藥公司生物部高級科學家，推動了硫酸轉移酶小分子抑制劑及重組抗體製藥的研發。從2004年開始擔任美國Taconic生物科技公司分子生物學部主管，率領十餘位科學家成功開發建成四百餘種轉基因小鼠及大鼠實驗動物及疾病模型。在PNAS、Mol Cell Biol.、J. Biol. Chem.等高水平雜誌發表論文10餘篇。歐陽博士於2012年加入賽業生物科技（ Cyagen Biosciences）公司，主要負責轉基因鼠及基因敲除小鼠平台的管理及優化。

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