張鋒連發兩篇《Nature》子刊文章 細述可能超越CRISPR-Cas9的新編輯技術

CRISPR-Cas9在全球各地的實驗室中大放光彩，並且已經被應用到了臨床上且證明了其威力。但CRISPR-Cas9有其局限性：上個月末Nature Methods上的一篇「Unexpected mutations after CRISPR–Cas9 editing in vivo」就指出了在全基因組測序研究中，CRISPR-Cas9編輯會令小鼠產生了上千個非目標基因突變，由此而引發關於這一技術精確性和安全性的一系列探討。當然這篇文章並不是對CRISPR-Cas9技術的蓋棺定論，但是一些科學家已經在尋找更為特異有效的新基因組編輯技術了。

2015年，麻省理工學院的張鋒研究組發現CRISPR還有一個好朋友——Cpf1。CRISPR-Cpf1也能在crRNA的引導下在人類細胞中剪切目標DNA，被稱為是新一代的CRISPR基因組編輯系統。今年張鋒研究組在多篇發表於Nature Biotechnology 上的文章中詳細介紹了這種新系統。

從CRISPR-Cas9到CRISPR-Cpf1

CRISPR系統編碼的RNA引導核酸內切酶對於細菌適應性免疫至關重要。CRISPR-associated (Cas)核酸酶可以很容易被重編程來切割靶DNA序列，在各種生物體中實現基因組編輯。其中的一類核酸酶Cas9蛋白與兩種短RNAs：crRNA和tracrRNA形成複合物。最常用的Cas9直系同源物SpCas9利用了在5′末端包含20個核苷酸(nt)與靶DNA位點「前間隔序列」（ protospacer）區域互補的crRNA。

crRNA和tracrRNA通常結合成大約100-nt的單導向RNA (gRNA)，指導SpCas9的DNA切割活性。有效地切割還要求SpCas9識別前間區序列鄰近基序（protospacer adjacent motif,PAM)。當前，研究人員已採用許多不同的方法確定了SpCas9核酸酶與不同gRNAs配對的全基因組特異性。並構建出了一些全基因組特異性顯著增高的SpCas9變體。

同時科學家們也在不同類型的細菌中搜尋成百上千種的CRISPR系統，希望尋找具有一些有用的特性，可改造用於人類細胞的酶。結果來自氨基酸球菌屬（Acidaminococcus）和毛螺菌科（Lachnospiraceae）的Cpf1酶成為了兩個有前景的候選物，張鋒等人在研究中證實了其可以靶向人類細胞的基因組位點。

不同於SpCas9，Cpf1隻需要一個42-nt的crRNA，這一crRNA在它的3′端有23 nt與靶DNA序列的前間隔序列互補。此外，SpCas9識別的是前間隔序列3′端的NGG PAM序列，而AsCpf1和LbCpf1識別的是前間隔序列5′端的TTTN PAMs。早期的一些實驗表明，可以重編程AsCpf1和LbCpf1核酸酶來編輯人類細胞中的靶位點，但只在少量位點對它們進行了測試，且尚未確定它們的全基因組特異性。

（Cas9，Cpf1及其各自的感染機制）

之後為了闡明Cpf1識別和切割靶DNA的機制，張鋒研究組進行了深入探討，2016年他們在Cell上發文，報告了氨基酸球菌屬（Acidaminococcus sp）Cpf1 (AsCpf1)與嚮導RNA和靶DNA複合物的晶體結構，解析度達到2.8 埃（?）。

AsCpf1採用了一種二裂片（bilobed）結構，RNA-DNA異源雙鏈核酸分子束縛在中間通道內。他們通過比較AsCpf1和Cas9的結構，揭示出一些驚人的相似性和主要的差異，由此解釋了它們獨特的功能。AsCpf1包含RuvC結構域和一個推定的新核酸酶結構域，它們分別負責切割非靶向及靶向DNA鏈，由此生成交錯的DNA雙鏈斷裂。AsCpf1藉助了一些鹼基和形狀讀取機制來識別5′-TTTN-3′PAM。張鋒《Cell》發表CRISPR研究新成果

之後他們同事證實兩種Cpf1核酸酶AsCpf1和LbCpf1在人類細胞中的打靶效率與廣泛使用的SpCas9相當。他們還證實利用來編程Cpf1核酸酶的crRNA 3′端有4-6個鹼基對單鹼基錯配不敏感，而crRNA這一區域的許多其他鹼基則對單鹼基或雙鹼基替換高度敏感。針對兩種Cpf1核酸酶採用GUIDE-seq測序方法和靶向深度測序分析，他們證實與20種不同的crRNAs配對一半以上的無法檢測到脫靶切割。

CRISPR-Cpf1的新作用：多重基因編輯

過去用Cas9靶標多個基因組位點需要構建多個或者很大的表達載體，使這種基因組編輯技術受到一定的局限。研究人員發現，Cpf1能夠加工自己的CRISPR RNA (crRNA)。而且Cpf1介導的pre-crRNA加工是獨立於DNA剪切的。這種能力可以用來簡化多重基因組編輯。張鋒研究組在2016年年底設計CRISPR陣列，用一個載體同時在哺乳動物細胞編輯了四個基因，在小鼠大腦編輯了三個基因，初步進行了這方面的研究。

今年朱健康研究組利用Francisella novicida Cpf1 (FnCpf1)和 Lachnospiraceae bacterium ND2006 Cpf1 (LbCpf1)對水稻進行單位點和多位點基因敲除的測試，研究表明上述兩個Cpf1隻需一條非常短的20-21bp的直接重複序列（direct repeats, DR）加上22-24bp的靶位點識別序列（guide）即可實現單基因敲除，更重要的是，把多個DR-guide單元直接串聯，只需要一個啟動子驅動即可簡單高效地實現多基因敲除。該研究利用4個DR-guide單元組成的CrRNA短陣列分別對水稻RLK和CYP81A家族的四個基因進行編輯，各位點的敲除效率達到40-75%。

這一系統簡單、高效地在水稻中實現了多基因定點編輯，拓展了CRISPR系統在植物中的應用，為水稻基因組定點編輯提供了一個新利器。

為了詳細介紹CRISPR-Cpf1的多重基因編輯作用，今年張鋒研究組在Nature Biotechnology雜誌上發文，證明Cpf1在體外和哺乳動物細胞中最多能夠切割4個crRNA的陣列（Array）。這樣，單個啟動子就能驅動crRNA陣列的表達，而不需要表達其他的核酸酶，如Csy4。

在張鋒實驗室的大多數實驗中，他們使用了共表達Cpf1和crRNA陣列的單個載體。當表達crRNA陣列、Cpf1和GFP標籤的單個質粒轉染時，6.4%的HEK293T細胞實現了4個目標的編輯。不過，若轉染多個質粒，其中每個質粒表達一個crRNA，再加上一個Cpf1表達載體，4重編輯的細胞僅為2.4 %。如何利用CRISPR/Cpf1系統實現多重基因編輯

除了張鋒以外，一些基因編輯研究領域的科學家們也在進行CRISPR-Cpf1的研究，因此這也正在逐漸成為了CRISPR專利之戰的新戰場。《Nature》細述CRISPR專利大戰第二季：四個重要的劇透

原文標題

Engineered Cpf1 variants with altered PAM specificities

Multiplex gene editing by CRISPR-Cpf1 using a single crRNA array

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