中國科學家首次在猴子上實現一步基因全敲除

敲除了Prrt2基因的猴子。來源：Zuo E, etc., Cell Research, 2017

撰文 | 王承志 （《知識分子》特約撰稿人）

責編 | 陳曉雪

自新的基因編輯工具CRISPR/Cas9到來，基因編輯正變得前所未有地容易。科學家已經使用該技術在多個物種中實現基因的敲除或者修改，也就是大家通常所說的轉基因動物。通過囊胚注射或者受精卵時期直接注射核酸酶（如Cas9），科學家已經可以製備從嚙齒類到靈長類的各種哺乳動物的轉基因模型。這些動物模型極大地促進了人類對基因功能的理解，也對在製藥等領域的應用有著深遠的影響。

但是，當前的基因編輯方法在製備轉基因動物時通常出現鑲嵌表型，也就是說動物身體一部分細胞的基因是被修改過的，而另一部分則不是。科學家通常的做法是通過雜交的方式在這些動物的後代中篩選出純合表型（也就是該動物所有的細胞都是同一種基因型）的動物來做研究。這種方法在小鼠等較低等的哺乳動物中是常用的手段，但是在高等哺乳動物比如靈長類動物中則成本過高。以猴子為例，其哺育周期長達5-6年（想想看，等猴子長大的時間都夠研究生畢業兩次了），而且每胎通常只生1隻。因此，在高等哺乳動物中開發高效的基因編輯方法有巨大的實用價值。

最近，中國科學院上海神經科學研究所研究員楊輝和同事合作實現了一種在靈長類動物中一步完全敲除多個基因的方法。6月6日上線的《細胞研究》(Cell Research)發表了這一研究。

「迅速建立基因編輯的猴子模型具有重要意義，特別是一步就可做到完全的基因敲除。」中科院生物物理研究所研究員王曉群評論說。他指出，高效的基因編輯效率，可以降低對受精卵以及代孕母猴的需求，進一步降低了基因編輯的成本。

這種方法的核心是在敲除的目標基因的同一個外顯子上設計多個sgRNA（被Cas9蛋白用來在基因組上定位的RNA序列）。研究人員首先在囊胚細胞中進行了原理的驗證：在已經插入綠色熒光蛋白的細胞中設計了4條sgRNA（A，B，C，D），然後分別單獨或聯合使用這些sgRNA，結果發現同時使用兩條或多條sgRNA時，所有細胞的熒光都消失了。

在囊胚細胞中敲除綠色熒光蛋白。來源：Zuo E, etc., Cell Research, 2017

然後，研究人員在小鼠模型上實驗了這種方法。他們選取了Tyr基因，因為該基因敲除後小鼠的色素沉著無法發生，基因是否被敲除可以直觀地通過小鼠毛色判斷。他們發現當只有一條sgRNA時，只有20%左右的後代中出現基因敲除的性狀，當同時使用兩條sgRNA時，一些組合可以達到70%左右的成功率，而當使用三條或四條sgRNA時，後代中100%出現成功敲除的性狀。他們進而選取了Y染色體上的多個基因進行測試，證實了這種方法的有效性。

敲除小鼠的Tyr基因。來源：Zuo E, etc., Cell Research, 2017

接著，他們在猴子模型中檢驗了這種方法。在敲除Prrt2基因的實驗中，他們同時轉入靶向第3號外顯子的三條不同的sgRNA，在獲得的11個胚胎中有10個是完全敲除的，而只使用1條sgRNA的實驗中，獲得的8個胚胎中有5個沒有任何敲除，而剩餘的3個則是不完全敲除。當把不同處理條件下得到的胚胎植入母猴子宮內發育後，他們分析了子猴的基因型。使用3條sgRNA的實驗組共得到兩隻子猴，其中一隻為Prrt2基因完全敲除，另一隻為不完全敲除。而只使用1條sgRNA的對照組中，他們得到了4隻存活的子猴，其中三隻為不完全敲除，而另一隻沒有發生敲除。通過對Prrt2基因完全敲除的11號子猴全基因組測序，他們也沒有發現這種方法有明顯的脫靶效應（即在基因組其它位置引起突變）。

該文章的通訊作者楊輝說，這項研究除了可以降低靈長類動物的基因編輯成本，也使得在活體內大規模檢測基因功能提供了可能。他介紹，以一次篩選數十個基因為例，如果使用傳統方法直接用老鼠來做篩選的話很少有實驗室可以承受這樣的成本和工作量，但是用這套技術，一個熟練的技術人員一天就能做完所有胚胎注射，兩個月就能出結果。「這不僅節約大量成本，而且更加符合動物福利3R原則（3R為Replacement，Reduction，Refinement，即替代、減少和優化），」楊輝說。

「如果能夠推廣普及，（這個方法）將會很大地推動我國靈長類動物的研究，當然，也會對其他模式動物的基因編輯技術起到推動作用。」王曉群說。他同時強調，這一高效率的方法是否適合其他的重要基因，還需要進一步的結果驗證。

參考文獻：

Zuo E, Cai YJ, Li K, et al. One-step generationof complete gene knockout mice and monkeys by CRISPR/Cas9-mediated gene editingwith multiple sgRNAs[J]. Cell Research, advance onlinepublication 6 June 2017; doi: 10.1038/cr.2017.81

http://www.nature.com/cr/journal/vaop/ncurrent/full/cr201781a.html

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