咳嗽變異性哮喘與典型支氣管哮喘患者外周血樹突狀細胞的變化

支氣管哮喘是以嗜酸性粒細胞為主的多種炎性細胞參與的氣道慢性炎症性疾病，主要是I型超敏反應(過敏性反應)所引起。外周血樹突狀細胞(DCs)在誘導T細胞對吸入的抗原產生過敏反應中的作用，已被公認為是氣道變態反應必需的始動因素。

咳嗽變異性哮喘與典型支氣管哮喘患者外周血樹突狀細胞的變化

劉曉帆，耿 爽，胡 軼，張衛明，王如娟

(華中科技大學同濟醫學院附屬武漢中心醫院呼吸內科，湖北武漢430014)

[摘要]目的：計算咳嗽變異性哮喘(CVA)、典型支氣管哮喘(CA)患者，其外周血中樹突狀細胞(DCs)及亞型髓樣樹突狀細胞(mDC)、漿細胞樣樹突狀細胞(pDC)比例和數量的變化，了解咳嗽變異性哮喘與典型支氣管哮喘之間是否有類似的免疫學發病機制。方法：選取CA患者20例，CVA患者17例，對照組健康人17例，使用流式細胞術檢測和計算CA組與CVA組受試者外周血中DCs及其兩個亞群：pDC和mDC所佔比例和數量的變化。結果：咳嗽變異性哮喘與典型支氣管哮喘患者相比，其外周血樹突狀細胞及其亞型的數量和比例均無明顯差異，咳嗽變異性哮喘、典型支氣管哮喘患者較健康對照組，pDC數量及比例的增高明顯，mDCs/pDCs的比值降低有統計學差異。結論：咳嗽變異性哮喘與支氣管哮喘的發病機制在免疫學上類似，由於pDCs比例和數量的增多引起Th2細胞數量增多，造成Th1/Th2平衡向Th2細胞偏移。

[關鍵詞]典型支氣管哮喘；咳嗽變異性哮喘；漿細胞樣樹突狀細胞；髓樣樹突狀細胞

[中圖分類號] R 562.2＋5

[文獻標誌碼] A

[文章編號]1000－9965(2017)01－0063－06

doi：10.11778/j.jdxb.2017.01.011

[基金項目]武漢市衛計委基金(WX16C45)

[作者簡介]劉曉帆(1987－)，女，研究方向：呼吸系統疾病的免疫學發病機制。氣道佔位性疾病的相應治療

支氣管哮喘是以嗜酸性粒細胞為主的多種炎性細胞參與的氣道慢性炎症性疾病，主要是I型超敏反應(過敏性反應)所引起。外周血樹突狀細胞(dendriticcell，DCs)在誘導T細胞對吸入的抗原產生過敏反應中的作用，已被公認為是氣道變態反應必需的始動因素^[1]。

目前各種體內外實驗均證實，DCs是人體內功能最強大的抗原呈遞細胞，在免疫應答的啟動、調控上發揮重要作用。DCs是人體免疫反應的始動者，並且只有DCs有獨特刺激幼稚型(naive)T細胞的能力^[2]，在不同的內環境中，使其向Th1、Th2、Treg細胞分化^[3]。近年來發現，人類DCs依據其來源可分為兩個亞群：骨髓系來源的髓樣樹突狀細胞(myeloid dendritic cell，mDC)和淋巴系來源的漿細胞樣樹突狀細胞(plasmacytoid dendritic cell，pDC)^[4－5]。

mDC在TNF-α(tumor necrosis factor-α，TNF)的刺激下產生大量的IL-12，能夠強有力地誘導Th0細胞向轉換成為Th1型分化^[6－7]，pDC細胞能夠誘導Th0轉換成為Th2細胞^[8]。因此，mDC與pDC分別被認為是引起Th1和Th2細胞反應的APC細胞。mDC和pDC比例的改變，間接顯示了人體內Th1與Th2細胞之間的平衡關係。

在2002年，日本學者根據傳統的免疫學標記法，首次發現了哮喘患者外周血中mDC和pDC的數量和比例出現了失衡^[9]。隨著發現新的人外周血樹突狀細胞特異性標誌的單克隆抗體BDCA-1、BDCA-3在CD19^＋B細胞和mDC上表達，BDCA-2和BDCA-4在pDC上特異性地表達^[10]，新一代標記人外周血DC細胞的試劑盒應運而生，它將更精準地標記不同亞型的DC細胞，更為準確地計數DCs細胞亞型的數量和比例，為樹突狀細胞相關的研究提供了更好的方法。

咳嗽變異性哮喘的臨床表現是以夜間咳嗽為主的慢性咳嗽，而無典型支氣管哮喘的喘息和呼吸困難等癥狀。咳嗽變異性哮喘(cough variant asthma，CVA)具有包括氣道高反應^[11]、氣道嗜酸性粒細胞炎症^[12]和氣道重塑^[13]等與典型支氣管哮喘類似的病理生理學特徵，因此被認為是支氣管哮喘的一種特殊類型。很多支氣管哮喘患者在起病最初階段僅以咳嗽為主要臨床表現，若未經積極治療，有30%～40%的成年CVA患者進而出現喘息、呼吸困難等癥狀，發展成為典型的支氣管哮喘^[14]，因此很多專家學者將CVA看做是典型支氣管哮喘(classic asthma，CA)的前期階段。研究DCs在不同疾病CA、CVA的患者外周血中是否有不同的表現，將有助於更進一步地了解哮喘的發病機制。

本實驗採用最新的試劑盒分別對咳嗽變異性哮喘患者、典型支氣管哮喘患者與健康人的外周血樹突狀細胞及其亞型的數量和比例進行檢測。

1

材料和方法

1.1 研究對象

2014年12月至2016年6月在武漢市中心醫院呼吸內科門診及病房、武漢市中心醫院體檢中心募集到的典型支氣管哮喘患者20例，咳嗽變異性哮喘患者17例，健康對照者17例，所有納入實驗對象均無吸煙史。其中，咳嗽變異性哮喘患者組17例(男性9例，女性8例)，平均年齡(43.06±18.50)歲。

患者年齡均＞18歲，咳嗽時間＞8周，胸部X線檢查未見明顯病變。符合咳嗽的診斷與治療指南(2009版)中咳嗽變異性哮喘診斷標準^[15]。氣管哮喘患者組20例(男性11例，女性9例)。平均年齡為(40.70±11.76)歲。納入的患者均符合支氣管哮喘防治指南^[16]的診斷標準。正常對照組17例(男性8例，女性9例)，平均年齡(47.89±11.76)歲。通過武漢市中心醫院體檢中心體檢後，選擇與實驗組年齡、性別組成相當的成年健康人。

各組試驗對象年齡無統計學差異(P＝0.307)，所有入選者近8周內沒有感染性疾病，無過敏性疾病、糖尿病、類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡、重症肌無力等疾病病史及家族史。通過血常規、血生化全套、尿常規、心電圖、腹部B超、胸部透視等常規體檢，均無異常。人群分布特點見表1。當地的倫理委員會批准實驗的進行。

1.2 方法

(1)流式細胞術分類血細胞並計數 取人肘靜脈血體積2mL，加入肝素抗凝管，30min內將血樣通過血細胞計數器(XT-1800i Sysmex Europe，Norderstedt，Germany)對血細胞分類，計數白細胞數量。

(2)流式細胞術計數DCs亞型比例 分別從抗凝管中取體積為300μL血液加入兩個12mm×75mm流式管，實驗管中加入體積為20μL抗BDCA的複合抗體(包括樹突狀細胞亞型的特異性表面標誌BDCA1、BDCA2，及CD14和CD19抗體)，對照管加入體積為20μL的複合對照抗體(所購試劑為德國美璇旎試劑公司的人血樹突狀細胞試劑盒)。混勻抗體，加入體積為10μL的死細胞識別劑。輕輕混勻，將血樣放在冰上，60W 燈泡3～5cm，照光孵育10min。每管加入體積為4mL紅細胞裂解液，避光裂紅10min後離心(300g×5min)，棄上清。用PBS(PBS中包含質量分數1%小牛血清白蛋白、0.1%疊氮化鈉、2%胎牛血清和1%的人血清)將細胞沖洗乾淨，調整細胞的數量為1×106/mL後固定。4℃避光冷藏，24h內通過流式細胞儀(型號：Epics Altre，Beckman Coulter，USA)檢測，結果見圖1，數據通過Cellquest軟體分析獲得。首先在Forward Scatter vs Side Scatter散點圖中圈定單個核細胞區R1，再將CD14＆CD19-PE-cy5表達為陰性的細胞設為R2(除外B細胞及外周血單核細胞)，再將Anti-BDCA1-PE＋設為R3(mDC)、Anti-BDCA2FITC＋設為R4(pDC)，每管樣品至少檢測1×105 個細胞。在檢測陽性細胞百分率前，以相應同型抗體染色細胞作陰性對照確定統計學分區。

(3)計算外周血樹突狀細胞的絕對數 DCs各亞型細胞數量計算方法：白細胞數/mm³×外周血各亞型DCs所佔比例。mDC/pDC比例計算方法：mDCs數量/pDCs數量。

1.3 統計學處理

實驗數據以(x±s)表示，應用SPSS17.0軟體對數據進行分析。計量資料用t檢驗，組間差異選用不配對的t檢驗。當P＜0.05時，具有統計學差異。

2

結果

CD14、CD19表達雙陰性的細胞為DCs，然後以Anti-BDCA1陽性表達界定mDCs亞群，Anti-BDCA2陽性表達pDCs。結果表明，吸煙組與對照組相比，DCs及其亞群的比例和數量有所不同。

(1)與對照組(41.77±12.21)/mm³相比，咳嗽變異性哮喘組外周血DCs總數(62.40±30.98)/mm³與典型支氣管哮喘組(70.25±26.70)/mm³增高具有統計學差異(P＝0.004)。咳嗽變異性哮喘組與典型支氣管哮喘組組間無統計學差異(P＝0.800)(圖2a)。咳嗽變異性哮喘組外周血mDC數量(27.79±20.92)/mm3 與典型支氣管哮喘組(34004±20079)/mm3的改變無明顯統計學差異(P＝0.394)。(圖2b)。較對照組外周血pDC數量(14.98±6.98)/mm³，咳嗽變異性哮喘組(34.61±14.98)/mm³與典型支氣管哮喘組(36.21±14.53)/mm³增高具有統計學差異(P＝0.000)。而咳嗽變異性哮喘組與典型支氣管哮喘組組間無明顯統計學差異(P＝0.707)(圖2c)。

(2)各實驗組DC、pDC、mDC細胞所佔外周血細胞的百分率，對照組[DC% 為(0.75±0.19)%，mDC%為(0.48±0.13)%，pDC%為(0.27±0.12)%]，咳嗽變異性哮喘組[DC%為(0.92±0.33)%，mDC%為(0.39±0.24)%，pDC%為(0.53±0.1)%]，典型支氣管哮喘組[DC%為(1.08±0.51)%，mDC%為(0.53±0.37)%，pDC%為(0.56±0.24)%]。DC%的組間具有統計學差異(P＝0.022)(圖3a)、mDC%無統計學差異(P＝0.330)(圖3b)、pDC%具有顯著統計學差異(P＝0.000)(圖3c).

(3)對照組外周血mDC/pDC為(2.12±1.26)，咳嗽變異性哮喘組為(0.84±0.60)，典型支氣管哮喘組為(1.06±0.60)。組間具有統計學差異(P＝0.018)。多重比較後，咳嗽變異性哮喘組與對照組組間具有明顯統計學差異(P＝0.000)，典型支氣管哮喘組與對照組組間有明顯統計學差異(P＝0.000)，咳嗽變異性哮喘組與典型支氣管哮喘組組間無統計學差異(P＝0.446)(圖4)。

(4)對照組為(66.73±33.99)/mm³咳嗽變異性哮喘組為(222.54±214.41)/mm³，典型支氣管哮喘組為(454.39±514.54)/mm³，咳嗽變異性哮喘組與典型支氣管哮喘組實驗者外周血嗜酸性粒細胞較正常對照組增高，具有統計學差異(P＝0.003)。多重比較後，咳嗽變異性哮喘組與對照組組間具有明顯統計學差異(P＝0.024)，典型支氣管哮喘組與對照組組間有明顯統計學差異(P＝0.010)，咳嗽變異性哮喘組與典型支氣管哮喘組組間無統計學差異(P＝0.209)(圖5)。

3

討論

實驗結果表明，與健康對照組相比，咳嗽變異性哮喘、典型支氣管哮喘患者組外周血中pDC的數量明顯增多，mDC/pDC下降具有明顯統計學差異。

mDC∶pDC之間的平衡向pDC方向發生漂移。而在咳嗽變異性哮喘與典型支氣管哮喘之間，外周血中pDC細胞數量及其所佔外周血細胞比例的改變無明顯統計學差異。在免疫應答反應初期，DCs細胞的亞型是決定原始T細胞向Th1細胞或Th2細胞分化的關鍵因素之一。1999年，Rissoan及其課題組成員第1次發現人DCs細胞的亞型：mDC和pDC，同時發現不同亞型的DCs細胞能夠分別誘導不同類型的T細胞反應^[17]。mDC細胞能夠分泌大量的IL-12，優先誘導Th1細胞的產生，而pDC細胞分泌低濃度的IL-12，主要誘導Th0細胞向Th2細胞轉換^[18－20]。

pDC細胞是最主要的誘導Th2細胞反應應答的APC細胞。因此，無論是典型支氣管哮喘，還是咳嗽變異性哮喘中，pDC細胞增多致使mDC∶pDC失衡，進而引起了Th2細胞偏移。既往有觀點認為，哮喘病人血液中，mDC/pDC比正常人明顯降低，可能是mDC消耗過多引起^[21]。

在實驗中，測量樹突狀細胞及其亞型的數量後發現，與健康對照組相比，支氣管哮喘患者DC總數增高，而mDC的數量和比例改變無顯著差異，pDC的數量和比例增高明顯，表明DC細胞總數增多是由於pDC細胞增多而引起的。與mDC減少的觀點相悖。

支氣管哮喘患者組與咳嗽變異性哮喘患者組，外周血嗜酸性粒細胞的比例和數量均較健康對照組增高，考慮可能是由於pDC的增高，誘導致變態反應的Th2細胞增高，同時導致了Th1/Th2細胞的偏移。

實驗表明，咳嗽變異性哮喘與典型支氣管哮喘外周血DC、mDC、pDC的比例和數量，以及外周血嗜酸性粒細胞的數量均無顯著性差異，表明咳嗽變異性哮喘與典型支氣管哮喘有著類似的免疫學發病機制。

[參考文獻]略

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