知道通路中的相關靶點，要怎麼來驗證呢？

最新 07-13

今天和大家分享的是2017年6月發表在Science Translational Medicine上的一篇文獻。該文獻標題為「Targeting KRAS-dependent tumors with AZD4785, a high-affinity therapeutic antisense oligonucleotide inhibitor of KRAS」（回復170712可下載文獻，一周有效）。

一、科學假說

早在1982年，就有研究發現了KRAS是一個重要的原癌基因。KRAS是RAS GTP酶家族的一種的同工酶，主要催化GTP和GDP之間的轉化，從而影響細胞內外信號轉導。

KRAS基因具有高度突變活性，20%人類惡性腫瘤中發現活化的KRAS基因突變，其中就包括高度惡性的胰腺癌、結直腸癌以及非小細胞肺癌。研究者們一直致力於尋求直接靶向KRAS突變基因或間接抑制KRAS基因通路的方法來治療惡性腫瘤，但是，臨床試驗表明目前發現的這些方法並不能使患者獲益。

反義核苷酸（ASO）治療是指與目標基因序列mRNA互補配對的RNA，通過與mRNA結合成雙鏈，實現對目標基因特異性的Knockdown，消除該基因在疾病發生髮展中的作用。本研究證實了反義核苷酸（ASO）AZD4785在治療KRAS突變依賴型腫瘤的重要作用。

二、結果分析

本文有7張大圖：

1． AZD4785高效、高度選擇性下調KRAS mRNA轉錄和蛋白質合成；

2． AZD4785對KRAS野生型和突變型細胞增殖以及MAPK信號通路的影響；

3． AZD4785對MAPK通路的抑制作用不受該通路的負反饋調節；

4． AZD4785在KRAS突變型異基因小鼠肺癌模型中的有效性和葯代動力學；

5． AZD4785在KRAS突變型異基因肺癌PDX模型中的有效性和葯代動力學；

6． AZD4785在KRAS野生型異基因肺癌PDX模型中的有效性和葯代動力學；

7. 小鼠和猴模型研究系統性ASO治療的安全性和耐受性。

Fig.1 AZD4785是經過限制性乙酯化修飾(cEt)的二代ASO，對於野生型和突變型KRAS mRNA 3』非編碼區具有更高的選擇性和抑制活性，並且不需要其他藥物輔助就能夠進入到細胞內。

研究者首先在A431子宮內膜癌細胞中對AZD4785進行研究發現其高度選擇性地使KRAS mRNA選擇性下調，但是不影響同家族的HRAS和NRAS mRNA。

同時ZAD4785相應的使KRAS蛋白表達下降但是不影響HRAS和NRAS基因編碼蛋白的表達。AZD4785對KRAS基因的抑制作用呈現出劑量依賴性。

Fig.2明確了AZD4785對KRAS基因的高度特異性抑制作用後，研究者進一步在肺癌、結腸癌以及胰腺癌細胞中探究了AZD4785引起的KRAS基因表達的缺失對於腫瘤細胞增殖的影響，發現AZD4785對野生型和突變型KRAS基因的表達均有明顯抑制作用，但是只對KRAS突變型腫瘤細胞集落形成有明顯的抑制作用，而對野生型KRAS細胞則增殖則沒有明顯抑制。

進一步研究表明AZD4785僅減少KRAS突變的細胞內MAPK(RAF-MEK-ERK，調節KRAS活性)下游轉錄本DUSP6和ETV4轉錄。蛋白檢測也表明AZD4785僅對KRAS突變型腫瘤細胞MAPK下游通路有抑制作用。說明AZD4785能夠高度特異性抑制KRAS突變細胞的增殖。

Fig.3針對AZD4785對於MAPK通路的影響研究者也進行了研究，發現其僅對KRAS突變的細胞系中MAPK的抑制作用比MAPK特異性的小分子抑制劑效果更明顯，而對野生型KRAS細胞內MAPK下游通路的抑制效果不明顯。

並且與MAPK蛋白抑制劑不同的是AZD4785對於KRAS的抑制作用不受MAPK負反饋調節的影響，這一數據也支持將AZD4785與MAPK抑制劑聯合應用治療KRAS依賴性腫瘤的理論。

Fig.4-7為了進一步探究系統性反義核苷酸（ASOs）治療對於KRAS突變腫瘤的作用以及體內葯代動力學，研究者分別用系統性ASOs的方法治療攜帶有KRAS突變肺癌的裸鼠以及KRAS突變型或野生型的病人來源腫瘤細胞的裸鼠，發現在裸鼠體內，ASOs能夠選擇性下調KRAS，也驗證了系統性ASOs對於KRAS突變型肺癌能夠實現選擇性敲除突變的KRAS。

藥物代謝動力學以及小鼠和猴的模型也進一步證實了系統性ASOs用於治療KRAS突變腫瘤的安全性。