人類遺傳性疾病的大動物模型——ENU化學誘變豬

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EDITOR S NOTES

2017年6月底，國際知名期刊《eLife》雜誌在線發表了中國科學院動物研究所周琪院士、趙建國研究員和王紅梅研究員團隊聯合清華大學孟安明院士團隊、第三軍醫大學魏泓教授團隊、東北農業大學劉忠華教授團隊、解放軍總醫院楊仕明研究員團隊的最新研究成果。論文題為A pilot study of large-scale production of mutant pigs by ENU mutagenesis。值得注意的是，所有作者都署名「中國豬化學誘變聯盟（Chinese Swine Mutagenesis Consortium）」。聯盟團隊首次建立了豬的ENU化學誘變體系，開展了大規模的豬ENU化學誘變和突變體篩選研究。

撰文 陳蘇仁（中國科學院動物研究所幹細胞與生殖生物學國家重點實驗室）

人類遺傳性疾病

人類群體中約20%~25%的人都患有不同種類、不同程度的遺傳相關疾病。人類遺傳學研究表明4~5%新生兒患有遺傳病，癌症、糖尿病、冠心病、動脈粥樣硬化、高血壓、精神分裂、不孕不育等常見病與遺傳因素密切相關。

人類疾病動物模型的用途

由於個體遺傳背景的差異及研究材料的限制，人類遺傳病的深入研究必須通過動物模型實現。研究人員利用動物模型進行遺傳病機理的深入研究，藉助動物模型進行實驗性矯正或治療。獲得人類遺傳病動物模型的方法包括自發性動物模型（如自發的基因突變）、基因組改造和修飾（如基因敲除）、基因組誘變（如ENU化學誘變）等。基因敲除與插入技術是以基因為驅動的，需要明確要研究的基因是什麼，基因結構如何；而誘導點突變是以表型為驅動，具有高通量、大規模、無差別隨機性等優勢。

ENU致突變技術

乙基亞硝基脲（ethylnitrosourea, ENU）是一種強有力的化學誘變劑，主要誘發單鹼基發生突變，通過對動物進行ENU誘變篩選可以獲得很多由基因突變導致的疾病表型，從而為人類醫學研究提供相應的遺傳性疾病動物模型。研究表明，ENU對小鼠的突變效率高達0.2%，而且這種突變是隨機的，不具有任何的傾向性，與以基因敲除為代表的典型的基因驅動法相比，規模更大、速度更快、挖掘基因的力度更大。採用這種高效的隨機誘變方法對生長周期短的多胎動物進行誘變，有望在短時間內獲得數量可觀的突變個體，我們可以通過表型篩選以獲得我們感興趣的突變類型。ENU人工誘變已經在果蠅、斑馬魚、小鼠等動物中被證明是一種發現新的功能基因的有效方法，但在大動物上進行人工誘變以創造新的基因資源在國際上才剛剛起步。豬的基因組相比小鼠基因組更接近於人，通過人工誘變我們可以尋找到一些在小鼠中難以發現的人類遺傳性疾病相關的基因。

1994年，King等通過ENU誘變獲得生活規律異常的小鼠(Vitaterna et al., 1994)。1997年，克隆了Clock基因，這是表明ENU誘變技術獨特優勢的里程碑(King et al., 1997)。但是，缺陷表型的成功傳遞、突變基因的定位等是ENU誘變的難點與重點所在，ENU誘變也可能製造多位點的單鹼基突變，造成表型發生機制闡釋方面的困難。

Vitaterna MH, King DP, Chang AM, Kornhauser JM, Lowrey PL, McDonald JD, Dove WF, Pinto LH, Turek FW, Takahashi JS. (1994) Mutagenesis and mapping of a mouse gene, Clock, essential for circadian behavior.Science264(5159):719-25.

King DP, Zhao Y, Sangoram AM, Wilsbacher LD, Tanaka M, Antoch MP, Steeves TD, Vitaterna MH, Kornhauser JM, Lowrey PL et al. (1997) Positional cloning of the mouse circadian clock gene.Cell89(4):641-53.

巴馬香豬的ENU誘變策略

研究人員選擇了7~8月齡體重約為20~30千克的雄性巴馬香豬。ENU誘變劑量為65~85毫克/千克體重，選擇每周一次、連續三周的靜脈注射給藥方式（G0代）。最後一次給葯後2~3周，G0代香豬表現出精子質量下降，6~8周表現為無精子症。G0代香豬12~14周後生殖能力恢復正常（圖1）。

顯、隱性突變體的系統性表型篩選

顯性突變篩選：G0代誘變雄豬與正常雌豬交配產生G1代，G1代為攜帶ENU誘變突變的雜合體，可以檢測到顯性突變。研究人員在6,770個G1代中發現36個顯性突變系（突變率~0.27%），其中7隻突變豬具有顯性遺傳能力（19%，7/36）

隱性突變篩選：未出現突變表型的G1代雄豬與正常雌豬交配產生G2代.，G2代雌豬與其父親（G1代雄豬）交配，在G3代中檢測到隱性突變。7,800頭G3代成功篩選到了91個隱性遺傳突變體（圖2）。

基於上述ENU誘變與突變性狀的篩選，研究人員確定了大量顯性與隱性突變豬（圖3），如：先天性魚鱗癬（圖3J）、翼狀胬肉綜合征（圖3M）、體重增加（圖3N）、毛色改變（圖3A, E, G, H, I）等。目前，研究人員已利用基因組連鎖分析（GWLS）和全基因組測序（WGS）技術將10個致病突變/區域定位到了染色體上。

SOX10基因點突變導致內耳畸形

研究人員發現其中一隻內耳畸形的突變體與人先天性耳蝸畸形（Mondini內耳發育不全）病理表型高度相似（圖4A）。其致病位點被精確定位到SOX10基因第325位鹼基的錯義突變（A>T），其導致第109位氨基酸的改變(R109W)（圖4B）。該突變體是人先天性耳蝸畸形的首個大動物模型，並提示SOX10基因很可能是人先天性耳蝸畸形的重要致病基因之一。

FBXO32基因突變與後肢癱瘓有關

研究人員通過對後肢癱瘓突變家系的研究發現，發現其中一隻後肢癱瘓的突變體表現出後肢骨骼肌（半腱肌）和背最長肌的肌肉萎縮、間質纖維化，與人先天性足畸形病理表型高度相似（圖5A）。研究人員將突變定位到4號染色體上16-17Mb區域，該區域包含了12個功能已知的基因。其中一個基因FBXO32已經被報道是骨骼肌萎縮相關基因，且FBXO32在突變體的骨骼肌細胞中顯著異常的高表達（圖5B）。

結 語

CONCLUSION

熱烈祝賀「中國豬ENU誘變聯盟」第一篇重量級論文發表。該研究首次建立了豬的ENU化學誘變體系，規模化製備了大動物的突變體，推動了豬作為模式大動物的發展，為臨床疾病大動物模型的建立提供了全新策略。

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