轉染做不好，自掛東南枝

那是一個陽光明媚的上午，小編正要去參加PARTY，突然接到導師的電話說是試劑到了，可以開始做轉染實驗了……

導師的話怎麼敢不聽，可是小編是個放養的孩子，還沒有做過轉染實驗呢。怎麼辦？只能去求助師兄師姐了，好在師兄看在我平時請他吃辣條的份上，給了我一本《葵花寶典之細胞轉染》讓我自學。

翻開本子，第一頁介紹了細胞轉染的類型。

轉染（Transfection）是指將DNA或者RNA導入真核細胞中的過程。若DNA未與宿主細胞染色體整合，稱為「瞬時轉染」，若DNA與宿主細胞染色體整合并隨後者的複製而複製，稱為「穩定轉染」。

轉染的方法有很多，例如病毒轉染、顯微注射、脂質體轉染、電穿孔法……

轉染前，應根據實驗目的、實驗室現有的條件選擇合適的細胞轉染方法。

「原來除了導師讓我做的脂質體轉染之外，還有那麼多轉染方法啊。不管了，今天先主要學習一下脂質體轉染方法再說。」

脂質體轉染

原理：轉染試劑中的陽性離子與核酸中的陰性離子相結合後形成複合物。複合物通過細胞內吞作用將核酸轉移至細胞中。

基本步驟：

細胞轉染效率影響因素

細胞密度、細胞代數、DNA的質量、DNA與轉染試劑的比例、血清質量都將影響細胞轉染效率。

1、細胞質量

細胞代次：細胞在傳代過程中會逐漸老化，不要用「骨灰級別」的細胞。選擇低代次、處於對數生長期的細胞進行轉染。

剛復甦的細胞：每個人都有起床氣，細胞也有。剛復甦的細胞，應繼續培養1~2代，讓細胞完全「蘇醒」後再進行轉染。

細胞密度：轉染時，細胞密度應根據轉染試劑種類和實驗目的來確定。一般來說，轉染時的細胞密度應控制在50%~80%之間較好。

同時應注意在轉染後48h，細胞收穫時，細胞不要長得過「爆」。細胞接觸抑制會嚴重影響細胞的狀態（周期進程阻滯，凋亡增加等）從而影響實驗結果。

交叉污染：如果同一個實驗室同時培養兩種以上的細胞，那就有可能發生這樣的情節：A細胞不甘寂寞跑到B細胞家聊天然後就在那常住下了，從此以後A、B細胞傻傻分不清。

2、微生物

細胞污染的種類可分為細菌、真菌、病毒、支原體……所有污染都會產生錯誤的結果。在這些污染中，支原體污染較為普遍。

支原體污染幾乎可以影響所有細胞的生長參數、代謝、染色體結構，其結果可導致非典型轉染、轉染效率偏低、研究數據不準確。在轉染前可以使用環丙沙星提前處理一下細胞培養物。

如果發生污染最好還是扔掉細胞，重新轉染。

3、核酸質量

在轉染過程中，純度不高的DNA（帶有少量的鹽離子、蛋白、代謝物等其他雜質或提取的DNA中殘存內毒素）會嚴重影響轉染效率。

除此之外，DNA分子構象也會影響轉染的效率。其中超螺旋的質粒可達到較高的瞬時轉染效率。

DNA含量應該控制在4~6ug，如果超過10ug，轉染效率就會大大降低。

4、轉染試劑

在轉染前應優化質粒和脂質體的最佳配比。按照質粒：脂質體=

1:1,1:1.5,1:2,1:2.5,1:3,1:3.5的梯度比例來檢測最佳轉染比例（若質粒帶有熒光，可通過觀察每組熒光強弱來判斷轉染效率，若不帶熒光可通過qPCR來檢測各組轉染效率）。

每種轉染試劑都會提供一些已經成功轉染的細胞株列表和文獻，通過這些資料選擇適合本細胞系的轉染試劑。

5、血清

在轉染前應先篩選出能促進本細胞系生長良好的血清批號。

為避免干擾到DNA-脂質體複合物的形成，在轉染細胞時需用無血清無抗生素的培養基，以此來提高轉染效率。

在轉染後4~6小時內需更換培養基，一是為了去除具有毒性的脂質體，二是為了更換成有血清的培養基以提供更多營養物質給細胞。

如果想要在轉染時加入血清，則需要設置實驗對現有的條件進行優化，找到合適的轉染試劑。

6、操作

細胞鋪板

若在細胞鋪板時操作不注意，則很可能會導致細胞分布不均。在接種平板時，可以先用培養基潤濕整個板底，再加入細胞懸液。

轉染時間

正在分裂的細胞往往要比處於靜止狀態的細胞更易於攝取並表達外源DNA。因此對大多數轉染操作而言，細胞都應在轉染當天或轉染前一天進行接種。

試劑的配置

DNA與脂質體應充分混勻，混勻後靜止10～15min。（混勻時應用無血清培養基或PBS來稀釋。）

轉染時

DNA-脂質體複合物應緩慢加入培養皿中並同時輕搖培養皿，以確保複合物的均勻分布，避免局部濃度過高。

換液

動作應盡量輕柔，此時細胞極為脆弱、貼壁性變差、很容易在外力的作用下懸浮起來進而導致細胞在換液過程中的損失。

換液前，應先將培養基預熱。

「原來細胞轉染也有這麼多門道，我先試著做做看，等遇到解決不了的問題再去問師兄。」

合作微信：helixlife6

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