16個Small RNA樣本也能發5.9分文章

文章導讀

高分文章的光環不僅僅在於本身的閃光，更在於文章背後實驗工作基礎的紮實和結果的可靠。本期華大測序文獻解讀，來自華中農業大學作物遺傳改良國家重點實驗室近期發表的Small RNA研究文章——雄性不育棉花在高溫脅迫下參與生長素代謝調控的miRNA研究，該文發表在《The Plant Journal》雜誌上（影響因子：5.9）。科技君在這裡將給大家詳細呈現：這篇僅用16個樣本的Small RNA高通量測序研究, 如何成就高分文章的全要點。

長期高溫（HT）脅迫導致棉花的雄性不育，最終導致作物減產。為探究HT脅迫下miRNA表達在棉花雄性不育中的分子作用機理，該研究在常溫（NT）和高溫（HT）條件下，對HT不敏感（84021）和HT敏感（H05）棉花品種的花藥進行小RNA及降解組測序，該研究結果揭示了miR160、miRNA156等參與調控的植物激素代謝通路，對棉花在高溫脅迫下花粉生殖發育有重要作用，此項研究將為未來作物提高作物產量及推廣溫敏核不育在雜交育種的應用有重要意義。

前期研究基礎紮實

1、 已完成了1個高溫敏感（84021）和1個高溫不敏感（H05）兩種雄性不育系的基因表達水平研究，發現生長素代謝通路（Auxin Signaling Pathways）是花粉發育對高溫脅迫應答的重要代謝通路；

2、 已根據棉花花芽發育統計，將棉花發育階段分成細緻的14個階段。

以上步驟對目的研究樣本的選擇有重要指導作用。

樣本設計精細

根據前期生物學性狀研究統計結果挑選:

1、 調查溫度和花藥長度關係，採用遊標卡尺測量；

2、 在高溫處理7天左右,不育性狀的花芽長度一般是是6-14nm, 結合細緻的發育階段分類結果，因此挑選TS：四分體時期(6-7nm)；TDS：絨氈層退化階段(9-14nm) 兩個發育階段；採用與轉錄表達研究選取相同時期樣本;

3、 每個發育階段設置2個生物學重複。

Small RNA測序樣本選擇

信息分析思路清晰

精華點：採取逐級縮小miRNA研究範圍,並針對高表達以及差異表達顯著的miRNA研究其靶基因參與的代謝通路,進一步證實miRNA參與調控的主要功能, 解釋生物學現象。

驗證方法多樣

1、定量及靶向位點驗證

使用qPCR方法驗證miRNA和靶基因的定量，降解組高通量測序方法驗證降解靶基因以及5』-RLM-RACE驗證靶基因降解位點，與高通量測序結果一致。

2、功能驗證

使用過表達miR160株系，結果觀察到：過表達增強雄性不育系品種對高溫的敏感，不育性狀類似花藥不開裂的狀態，與ARF10 和ARF17表達受到抑制有關，從而激活植物生長素代謝通路，導致花藥不開裂。當加入外源生長素-吲哚乙酸導致在84021和H05在高溫狀態下也同樣產生明顯的雄性不育表型，進一步證明miR160的重要作用。

使用過表達的miR157抑制植物生長素代謝通路，在高溫脅迫後，同樣出現小孢子敗育和花粉不開裂表型，使得雄性不育系品對高溫更加敏感。

這篇高分文章帶來的重要啟示：

1 在做miRNA研究的前期或者同時進行基因表達的研究；

2 在選取樣本的前，需要做好生理生化指標及表型檢測，篩選表型差異大的樣本，這點非常重要，關乎在後續分析結果中是否能找到目的miRNA；

3 在分析過程中, 雖然有在龐大的數據分析結果,但可通過縮小目的研究範圍:如表達量範圍、差異倍數等等，集中精華結果以便深入研究；

4 在後期驗證中，不僅選取常見的qPCR方法驗證，更可以選取過表達或者缺失表達等情況進行正向或者反向驗證，或者增加代謝通路中常見的外源刺激物驗證表型表達，進一步證明實驗結論可靠；

5 除此之外，更重要的一點是，Small RNA研究需要選擇一個靠譜的高通量測序合作夥伴。

華大科技最早對Small RNA高通量測序技術進行研發，已完成多類物種的高通量測序實驗，經驗豐富，尤其是對微量樣本的實驗成功率高，對於珍稀樣本的研究的確是一個福音。近期華大Small RNA產品信息分析再次升級，miRNA的定量更加精確。

華大科技Small RNA產品優勢

參考文獻

[1] Ding Y, Ma Y, Liu N,et al. microRNAs involved in auxin signalling modulate male sterility under high temperature stress in cotton (Gossypium hirsutum).Plant J.2017 Jun 21. doi: 10.1111/tpj.13620.

撰稿：姜 瑩

編輯：市場部

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