微生物多樣性SCI文章的「套路」系列一——這些年我們做過的微生物群落結構分析

您是否還記得，小昌之前整理了一般微生物群落多樣性研究的「套路」（不了解的朋友可查看上一篇《微生物群落多樣性SCI文章的一般「套路」,你可知道？》）。大家也許還意猶未盡，那小昌接下來將通過幾篇系列文章為大家深度講解。今天小昌就先給大家理一理微生物群落結構差異分析方法與策略方面的知識。

1. 菌群整體結構分析及展示

首先，拿到數據後我們會對各個分類水平（門、綱、目、科、屬、OTU）做物種丰度統計表，再用表格去做各種圖形化展示，從而獲得對各樣本菌群的整體認識：如哪些菌是優勢菌，同組樣本及不同組樣本菌群結構是否相似或是否有較大差異。

那麼，我們先來看看如何圖形化展示菌群結構：常見的有多樣本的群落分布柱狀圖，樣本少的話還可以放餅圖；還有類似MEGAN輸出的單樣本或多樣本總體分類學組成樹狀圖、GraPhlAn軟體做的物種組成樹狀圖等等。

我們還是來一起看圖說話吧。

上圖是屬水平的菌群組成圖，數據來源於兩個不同的個體不同時間段的腸道菌群分析結果，大家會發現，通過柱狀圖即可輕鬆看出兩個個體優勢菌群的不同。柱狀圖雖然簡單，但卻能比較直觀的展示出樣本的優勢菌群組成，並能夠做初步的比較，在文章中相當常見，可在各分類水平作圖。文章中常見的為門、屬或者科水平的作圖。

上圖是多樣本總體分類學組成樹狀圖，在各分類水平比較樣本間物種組成。該圖的優點是能夠從多個分類水平展示及比較樣本間的物種組成，缺點是一次能夠展示的樣本數較少，且信息較多，不容易說明問題。

上圖是用GraPhlAn軟體對組內所有樣本或單個樣本的OTU物種注釋結果進行總體展示，可以從各分類水平境微生物的關係及丰度差異。一般展示的最低分類級別為屬，一個門一種顏色，節點大小表示物種丰度，默認標註丰度在 1%以上的物種。

2. 樣本中微生物複雜性評估(α-diversity)

做微生物群落結構分析時，一般會對樣本中微生物複雜性評估，即通過一些指數（如OTU數目，α多樣性指數）來了解樣本中微生物的複雜度。主要從樣本包含的微生物種類多少和丰度高低分布（均勻度）來評估，結果有觀測到的OTU數目（Observed_otu）、預測的OTU數目(Chao和ACE) 和多樣性指數值（Shannon指數和Simpson指數）等。常見的圖示有Rarefaction曲線及Shannon曲線，通過曲線可粗略觀察組內及組間樣本的多樣性是否有差異。如下圖在作圖時每組樣本一種顏色，通過Rarefaction曲線可以看出，相比Con組T組樣本的物種豐富度更高一些；Shannon曲線顯示出，相比Con組T組的多樣性更高一些。

還可以進一步做組間α多樣性指數來說明組間差異，結合結果來說明實際問題。如下圖可說明T組相比Con具有更高的α多樣性，且差異顯著。

3. 如何靈活應用PCA，以及基於Bray-cuits, Weighted Unifac等距離的Pcoa做菌群整體結構差異分析

這塊涉及到很多人所津津樂道的β多樣性。

β多樣性是對不同樣本/不同組間樣本的微生物群落構成進行比較分析。我們可通過OTUs的丰度信息表進行樣本間距離計算；也可以利用OTUs之間的系統發生關係，計算Unweighted Unifrac及Weighted Unifrac距離，然後，通過多變數統計學方法主成分分析（PCA, Principal Component Analysis)，主坐標分析(PCoA，Principal Co-ordinates Analysis)，非加權組平均聚類分析(UPGMA，Unweighted Pair-group Method with Arithmetic Means)等分析方法，從中發現不同樣本（組）間的差異。

說人話就是：不同樣本/不同組間比較常見的分析方法有PCA、PCoA、NMDS等，在分析過程中會用到Euclidean,Bray-cuits, Weighted Unifac, Unweighted Unifrac等多種距離演算法。這些演算法並沒有高低之分，主要根據不同的研究目的而採用更為適合的方法進行數據展示。如果實在不知道哪一種方法更適合，可以同時使用多個方法進行分析，最終挑選最能解釋生物學問題的方案。下面我們看看實際項目中如何靈活應用吧。

基於OTU水平的同一組數據，小昌分別選用PCA, 基於Bray_cutrtis, Unweighted Unifrac, Weighted Unifac的Pcoa及Nmds，共5種分析方法做了展示。

大家會發現效果不一，讓我們先來透露下這些結果背後的數據的故事。這組數據來源對照組、兩個不同時期的處理組。大家可以看到：PCA, 基於Bray_cutrtis, Unweighted_Unifrac距離的Pcoa,Nmds四種方法都能夠將Con組與其它組分開，但Pcoa效果要好於PCA；能將兩個處理A和B區別開的，Bray_cutrtis、Unweighted Unifrac明顯要好於其它方法。仔細觀Bray_cutrtis和Unweighted_Unifrac兩個結果會發現，Unweighted_Unifrac方法對於Con組的聚類效果要好於Bray_cutrtis組，而Bray_cutrtis演算法對於B組的聚類效果更好些，為什麼會出現這種結果呢，這就要進一步挖掘數據背後的原因了。對於Con組，由於是背景完全一致的小鼠，故腸道菌群的類型是基本相同的（即菌的進化關係較一致），Unweighted UniFrac考慮物種的進化關係及物種有無的變化，所以對於Con組，樣本間距離更近；而A組和B組樣本所用的處理方法比較劇烈，所以不論從菌的類型（菌的進化關係）及丰度上均發生很大的改變，所以Bray_cutrtis, Unweighted Unifrac兩種演算法都能較好的區分。細心的朋友可能還發現，這裡面還有一個E圖的坐標軸是PC2和PC3，這裡是為了進一步說明Unweighted_unifrac Pcoa這種方法，能將A組和B組區很好的區分開來。

一般地，做了組間差異分析後，看文獻時會發現其中還有一些顯著性差異的計算。如相似性分析（Anosim）、多因素方差分析（Adonis）及多元響應置換分析（Mrpp）等，以上分析方法均可用於判斷組間群落結構的差異是否顯著。這些分析與PCoA、NMDS等分析結果配合使用，增加結果的說服力。

飯不能一口吃飽，話不能一次說完，欲知後續，且請聽小昌下回分解。

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