研究染色質可接近性的freestyle

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染色質可接近性概念及研究意義

染色質是遺傳物質的載體。1879年，W. Flemming提出了染色質(chromatin)這一術語，用以描述細胞核中能被鹼性染料強烈著色的物質。

真核細胞染色質被緊密地包裝成一系列核小體組蛋白八聚體，每個組成的核心被147 bp的DNA纏繞近兩圈，然後被包含特定限制性核酸內切酶識別位點的DNA 序列分隔開。大多數基因組中的染色質都緊緊盤繞在細胞核內，但也有一些區域經染色質重塑後呈現出鬆散的狀態，這部分無核小體的裸露DNA區域被稱為開放染色質或染色質可接近區域，這種區域通常不超過幾百bp且表現出對DNaseⅠ的高度敏感。

真核生物轉錄調控過程是大量的順式調控元件與反式作用因子相互作用的結果，具有調控功能的順反元件通過結合染色質開放區域參與到真核生物轉錄調控的過程中以控制轉錄活性。比如，轉錄因子一旦結合到開放的染色質區域，就會招募其他蛋白，使附近的基因開始轉錄。轉錄因子與基因組結合時，取代了核小體的位置，暴露出DNA，使其對酶的切割更為敏感。在此基礎上，人們可以利用染色質對DNase的敏感性，鑒定活化的調控序列。

染色質開放性是動態的不是靜止的，整體的調控過程與染色質核小體的動態定位相關，因此，高效精確地定位基因組上的開放染色質位點、搞清核小體位置的動態變化，為成功地發掘基因組調控元件，乃至揭示基因表達調控機制提供重要線索和有效手段。

截止目前，關於開放染色質的研究已有很多成果，早在12年，來自美國華盛頓大學的科學家就得到了125種細胞和組織中的人類DNase?I超敏位點的圖譜，同時將這些信息與ENCODE中數據整合鑒定出了染色質可及性、轉錄、DNA甲基化和調控因子佔有模式之間的關係。另有科學家發現，僅占玉米基因組1％左右的開放染色質，決定著將近一半的玉米多樣性特徵。這一發現使科學家能夠更容易地開展轉基因玉米研究，開發出更耐旱或更高產的玉米品種，從而緩解人類面臨的糧食壓力。染色質可接近性在醫學領域也有顯著研究成果，來自斯坦福大學醫學院的研究人員揭示出，Nfib通過廣泛提高染色質的可接近性促進了癌症轉移。美國傑克遜實驗室的研究人員開發出一種新方法，通過對開放染色質進行全基因組分析，來確定導致既定類型白血病的細胞類型。

目前的染色質可接近的檢測方法主要通過酶解或者化學方法來分離可接近的或者受保護的區域DNA序列，分離得到的DNA再用二代測序的方法進行量化，以用於研究基因差異表達、細胞增殖、功能多樣化、疾病的發展。除了基於染色質對DNase消化和Tn5轉座的敏感性對基因組的調控序列進行定位和解讀，近期還有科學家提出了新的研究方法，下面小編就來帶大家看一下研究染色質可接近性的freestyle。

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研究染色質可接近性的方法

與依賴重疊組蛋白尾部修飾的組蛋白染色質免疫沉澱（ChIP-seq）相對比，染色質可接近可直接測量染色質結構的修飾對基因轉錄的影響。雖然ChIP-seq可直接檢測與轉錄因子結合的DNA序列，但一次測序只能檢測細胞中數百個處於活躍狀態轉錄因子的一個，檢出率較低。另外，染色質可接近性分析不需要引入潛在偏倚的抗體或表位標籤。所有染色質可接近性實驗的典型限制是缺乏達到準確和可重複的結果所需的重複次數標準，這是因為複製數取決於受限於檢測方法、檢測條件以及組織類型的信噪比。

目前用於研究染色質可接近的方法除MNase以外，其他DNase-seq, FAIRE-seq and ATAC-seq均直接分離染色質開放區域，下面是各方法的詳細介紹：

MNase-seq

通常稱為單鏈特異性內切核酸外切酶測序，主要利用限制性外切酶進行片段化處理，直到獲得被核小體包裹或者被轉錄因子綁定的區域為止。目前MNase消化法和二代測序聯合使用，通過定性和定量的方式來識別基因組範圍內的平均核小體佔據率以及定位。樣品量範圍比較廣為1到107個細胞，實驗的注意要點是甲醛交聯程度以104及MNAse的濃度選擇。

DNase-seq

該技術剛好和MNase-seq技術互補。利用DNaseI優先切割核小體被取代的DNA序列，對生成的片段進行測序，被用於檢測特定轉錄因子的結合位點。實驗準備周期長，樣品製備複雜。該技術要求細胞起始量較高，目前已開發出sc-DNase-seq技術來改善樣品量過多問題。

FAIRE-seq

調控元件的甲醛輔助分離法，和MNAse一樣，該方法需要藉助有機溶劑甲醛對DNA進行固定，不過是染色體中裸露的DNA，和DNase-seq一樣整體實驗准周期較長，樣品量要求104到107個細胞。信噪比低，解釋數據較困難，同時結果高度依賴固定效率。

ATAC-seq

可通過Tn5轉座酶，將易接近轉座酶核染色質區域序列複製出來，相比DNase-seq步驟更為簡單，只需500到50000個新鮮細胞。經過一次ATAC-seq，可以獲得染色體在某個特定的時空條件下所有開放染色質區域，並不僅僅局限於某個轉錄因子的結合位點，或者某個特定的蛋白保護區域。該方法容易出現線粒體DNA的污染，實驗過程中需要結合DNA酶或者CRISPR/Cas9的線粒體DNA去除技術。

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和轉錄調控高通量測序產品的聯合分析

染色質可接近性的研究可以獲得開放染色質區域的信息，所有在該條件下發生轉錄的基因以及順式調控元件均可以檢測到；配合RNA-seq以獲得相應的轉錄本信息，則可以找到相關基因的上游調控序列，整體分析該特定時空下的調控網路，並且相互驗證。另外，已證明在整個基因組上核小體的定位影響DNA的甲基化樣式，從同一個DNA分子得到DNA甲基化和核小體的定位可以使我們能夠更好地了解DNA甲基化和核小體定位是如何共同控制可以調節基因表達的染色質的可接近性。

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前沿研究

Buenrostro等將ATAC-seq的方法與Fluidigm的單細胞平台C1整合，通過簡單的程序利用微流控晶元完成捕獲、裂解、轉座、PCR等實驗過程，建立了自動化的單細胞染色質可接近性圖譜研究方法scATAC-seq。近期，北京大學李程研究組發表基於三維基因組數據的動態染色質可接近性模型。

轉錄組測序和染色質可接近的測序的聯合分析是聯合分析的一大亮點，和我們平時的研究內容緊密相關，後續我們將通過一篇經典案例來了解ATAC-seq和轉錄組分析的聯合應用。

參考文獻

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[5]Wang Y, Fan C, Zheng Y, et al. Dynamic chromatin accessibility modeled by Markov process of randomly-moving molecules in the 3D genome.[J]. Nucleic Acids Research, 2017.

本期先科普一下，下期咱們談談應用，將與大家分享一篇經典文獻：染色質可接近性與轉錄調控的聯合分析，敬請期待~

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