怎麼樣的臨床試驗才能登頂 Lancet？

近日瀏覽 Lancet 網頁，其主頁放了一篇關於兒童克羅恩病（Crohn s Disease，CD） 的隊列研究，筆者並非消化內科相關，而是呼吸內科一年級研究生，抱著建模方式或許可以借鑒到老師的臨床研究項目中的心態入了坑。

圖一，3 月 15 日 Lancet 的主頁截圖

本文針對兒童克羅恩病併發症預測的多中心的隊列研究，來自於 RISK Study。現在大多數 SCI 雜誌對於臨床研究接稿都要求試驗開展前已進行臨床試驗註冊，收完病人再去補是無濟於事的。

克羅恩病併發症分型：

狹窄型（structuring，B2）和穿透型（penetrating，B3），細胞外基質（extracellular matrix proteins，ECM） 形成和降解間的平衡與兩類併發症的聯繫。其異質性由宿主因素主導的，受環境和腸道微生物菌群的影響。

主要檢測了四個方面的特異性的指標：基因型、微生物血清學、迴腸基因表達、腸道微生物。

結果：建立了競爭風險模型預測併發症發生；有穿透型併發症風險的病人更應早期進行抗 TNFα 治療；腸道菌群方面，Ruminococcus 與狹窄型密切相關，而 Veillonella 與穿透型相關；在狹窄型病人中，迴腸 ECM 生成的基因表達上調，加入模型預測特異性大大增加。

接下來以 Result 解讀為線索，解讀大數據處理，分為 3 個部分。

01

第一部分解讀

疾病併發症競爭風險模型和早期抗 TNFα 治療的療效比較分析

圖三，隨訪時發展為狹窄或穿透併發症的生存曲線，圖 （A）為整個隊列，圖（B）為傾向匹配隊列。

隨訪時間為 3 年，縱坐標為無併發症的百分比，橫坐標是隨訪天數。早期抗 TNFα 的治療減少發展為 B3 的 3 倍風險，而對發展為 B2 無明顯影響，B3 風險高的病人更應該進行早期抗 TNFα 治療。

納入早期抗 TNFα 的治療隊列選用符合方案集（Per-protocol，PP）規則，只分析實際完成整個治療的。配對運用傾向評分匹配法（propensity-matched analysis，PSM），依託傾向評分法（propensity score analysis，PSA），消除觀察性研究的混雜因素，最終得到 1 個綜合變數： 傾向性得分。再使用貪心匹配演算法（greedy-matching algorithm），鉗值 （caliper）為 0.1 SDs。

表 1，疾病併發症的競爭風險模型和早期抗 TNFα 治療的療效比較分析

作者意圖建立風險分層模型來預測併發症發生的風險，以及加入早期抗 TNFα 的治療變數後對模型的影響。主要以 P 值決定是否將變數納入模型。風險比（hazard ratio，HR）可從圖中讀出。

相比於標準 Cox 比例風險回歸模型（standard Cox proportional hazard regression）關注的是臨床的某一結局（單終點），競爭風險模型（competing-risk model）可分析多潛在結局的生存數據。評價早期抗 TNFα 的治療，使用療效比較研究（comparative effectiveness research，CER）。

02

第二部分解讀

基因表達與併發症及其預測

基因表達通過第二代測序 RNASeq，運用到基因本體（Gene Ontology，GO）資料庫，ToppFun 工具找到有表達差異的通路，DAVID 生物信息資料庫來做功能注釋富集分析（functional annotation enrichment analyses）。

圖四（A），展示的是進展為併發症的病人迴腸表達上調的基因的比例，橫坐標是 B2（藍條） -B3（紅條）；縱坐標為富集明顯的表達上調的 19 個基因本體通路，括弧里是每條通路包含的基因數。

圖四 （B） 是發展為併發症的病人的迴腸基因表達組合的散點密度圖，橫坐標是 B2 vs B1，縱坐標是 B2 vs B3。基因差異表達倍數值（fold changes，FC），取log2是要縮小兩者差距。可以看出 ECM 基因在 B2 中表達增高。

圖四 （C） 展示的是火山圖，X 軸代表基因差異表達倍數（FC，log2），Y 軸代表統計檢驗的顯著性 （p 值，-log10）。比較 B2 low probability（併發症預測低風險，實際卻狹窄） 和 B1 protected（併發症預測高風險，實際卻沒發展為併發症）。B1 protected 中，線粒體呼吸鏈 （mitochondrial respiratory） 基因 （暗紅色點） 幾乎全部表達上調；B2 low probability 中，ECM 重塑基因 （亮藍色點） 表達上調。

以上是迴腸基因表達的分析，那麼如何將這個變數加入到競爭風險模型呢？

表 2，包含 ECM 基因標誌的競爭風險模型

文章將圖四（A） 中 B2 最低端的 ECM 結構成分 （位於 pathway 富集分析的分子功能部分） 的 70 個基因中的 PC1（first principal component） 作為基因標誌，納入到模型中，運用了主成分分析（Principal component analysis，PCA）。用 AUROC、靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值評估 ECM 基因標誌納入對模型的判別能力的影響，發現其在預測 B2 時起到了關鍵的作用。

表 3，appendix 中的 Table S4 上調的迴腸基因的通路富集分析，B2（這張圖可以複習之前講過的很多知識點）

03

第三部分解讀

風險預測模型的有效性驗證 （Risk Prediction Validation）

建模相當於發揮分類器的作用，交叉驗證（Cross Validation，CV）是常用的模型驗證方法，可以從有限的數據中獲得儘可能多的有效信息，流程：選取模型參數導入訓練數據（training set）建模用驗證數據（validation set）測試模型效果。估計隊列的樣本量時，使用了模擬數據做從而確定樣本量。當樣本量支持將數據分為兩份，用有效性驗證（split sample）；樣本量小，選用留一法（leave-one-out，LOOCV）驗證。

文章中使用的 STROBE（Strengthening the Reporting of Observational Studies in Epidemiology），是由國際醫學期刊編輯委員會 2004 年制定的寫作規範，投稿時應注意按規範書寫。

至此，通過三部分的解讀，探討怎麼樣的臨床試驗才能登頂 Lancet，如果這是一個作者寫的，我一定會說不會計算機的生物學家不是好醫生。

醫生作為主體參與臨床試驗是必不可少的，作者一欄中大多是多中心的 MD，所以筆者特意查了下裡面的 PhD，基本是生物信息、流病、基因組學分析的專業人士，可見一篇 Lancet 文章的發表是多學科的協作創新。

總之，走過基因組時代，我們又迫不及待地踏入了大數據時代，深度學習、神經網路、AI 這些原本活在計算機的語言同樣衝擊著生物醫學界，如何結合傳統生物學、基礎醫學對疾病機制進行深刻的認識，發掘診斷、治療的新靶點、新方法，生物信息學或許是新的路數。

本文接近於零基礎探討，希望給同樣的小白選手以思路，共同學習，純屬拋磚引玉，也望各路大神多多指點，分享經驗。鑒於公眾號閱讀的簡潔性，詳細版發在丁香園論壇上，歡迎有興趣的同道前來指導。

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