如何製作一枚醫學微晶元？

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原文以The making of a medical microchip為標題

發布在2017年5月24日的《自然》科技專題上

原文作者：Amber Dance

微流體設備有望簡化遺傳疾病的診斷。

在Dino Di Carlo位於加州大學洛杉磯分校的實驗室，生物工程師們一天中有許多時間都從頭到腳包裹得嚴嚴實實，而且看起來臉色蠟黃。這些工程師在潔凈室工作，在那裡，經過過濾的穩定氣流會去除空氣中的顆粒物。藍光或紫光會導致他們使用的光敏材料固化，所以只能使用奶黃色的燈光。

他們與該領域的其他科學家正在製造用於預處理和分析血液和其他流體樣本，以診斷基因突變（比如癌細胞攜帶的突變）的工具。此類工具一般不需要用到潔凈室，但Di Carlo實驗室開發的工具依賴於流體沿管道流動的能力，這些管道小到可能會被一顆灰塵堵住：這一領域被稱作微流體技術。理論上，這些在載玻片大小的晶元上開展的分析應該是快速而自動化的：輸入樣品，讀出結果，簡單得連新手都可以使用。但在實際中，這些設備很少能做到全自動運行，通常都需要一些樣品預處理過程。

上圖中的這款晶元由Fluidigm開發，可用於微流體系統中樣本基因組信息的分析；樣本甚至可以小至一個單細胞。

Fluidigm

包括Di Carlo在內的科研人員正在著手解決這些缺點，試驗各種材料和設計，好讓晶元更易製作。他們面臨的挑戰包括預測狹小空間內的流體行為，以及製作出高效廉價的晶元等。日本沖繩科學技術大學院大學的化學工程師Amy Shen指出，解決這些問題需要多學科合作。帶來的回報則包括節省實驗室時間和經費、開發加速遺傳病和傳染病診斷的醫療儀器等等。

通過微流體系統，科學家得以對珍貴或數量有限的樣品加以利用，在使用昂貴試劑時獲得更多的結果。對體積微小的液體進行操作使得快速並行分析成為了可能。由於只有機器才能操縱這麼微小的體積，微流體系統也有利於自動化實驗流程，從而減少了人為操作失誤。理想情況下，就連只受過極少訓練的技術人員也能開展試驗。

這一目標仍然難以實現。目前，開發人員重點關注的是將分析血液和其他體液中DNA或RNA的過程微型化，比如開發微小版的聚合酶鏈式反應（PCR）儀來複制和量化稀有的基因序列，或通過雜交來連接核酸與熒光探針。其結果是，微晶元方法往往需要使用已經經過處理的生物材料：舉例來說，需要先去除會干擾反應的組分。位於法國巴黎的基礎科學研究機構，法國國家科學研究中心（CNRS）的研究主管Jean-Louis Viovy表示，主要瓶頸在於「試圖擴大微流體領域的工具箱，從而把從實際樣本到獲得結果過程中的各個步驟都集成在微流體系統中。」 Viovy也是巴黎附近的微流體公司Fluigent的技術創始人。

清除疾病

Di Carlo的實驗室為一種特殊的樣本處理過程開發了方法：分離循環腫瘤細胞（CTCs）。CTCs是一種血液腫瘤標誌物，能揭示出腫瘤起源和引起腫瘤的突變。實驗室使用了常用的光刻技術，以透明硅橡膠材料PDMS為原材料製作晶元。在潔凈室，工程師將光刻膠鋪在圓形矽片（即製作計算機微晶元的材料）上。 然後，工程師模仿半導體業的流程，將列印出來的黑色「光掩模」（上有晶元所需的管道形狀，管道部分透光）覆蓋在光刻膠上，再將其在紫外光下曝光，使透光部分的光刻膠固化，從而產生與晶元管道結構相反的模具。

然後，Di Carlo的工程師回到普通實驗室，為了製作晶元，他們將液態的PDMS倒在先前做好的具有管道結構的矽片上，並在65攝氏度下烘乾，以固化PDMS。 最後，他們將一個載玻片與PDMS的底部粘合在一起，就製成了一個原型晶元；它看起來和摸起來都像是一種特別結實的透明膠狀物。整個過程大概需要一天。

Di Carlo說，一旦他們選定了一種能夠滿足他們目標的設計，他們就會訂製塑料版本的晶元。塑料晶元的製作過程與塑料玩具一樣。

大多數晶元製作技術產出的都是二維結構，但三維結構有時也很有價值。在Di Carlo正在設計的一種晶元中，他使用磁場將液體從一個狹窄的管道拉到一個更高、更寬的管道。隨著液體開始在較大的腔體中鋪展，表面張力會使它形成球體，進而變成液滴。Di Carlo說：「它基本上是一種納升級的移液器，這種操作是人手工無法實現的。」 晶元能通過這種分割方法將血液等流體分成多個離散的反應小室，從而同時進行多個實驗。

Box1：晶元設計技巧

微流體渦旋晶元中形成的層流微旋渦上的微珠軌道。

Dino Di Carlo/AIP Publishing

製作微流控晶元的過程一般始於用AutoCAD, Adobe Illustrator或SolidWorks等軟體繪圖。加州大學洛杉磯分校的生物工程師Dino Di Carlo說：「我們可以畫出管道的路徑。」

他說，微管道中的流體流動是可以預測的。但是，處理數據需要用到超級計算機。儘管軟體有所幫助，大多數研究人員還是更願意反複製作晶元，直到獲得他們想要的流動為止。Fluigent微流體公司的技術創始人Jean-Louis Viovy表示，Fluigent公司提供的軟體工具能幫助科研人員改進晶元設計。

Di Carlo課題組開發了他們自己的模擬軟體 ，名叫uFlow。他們認識到，微流控晶元經常包含重複的結構元素，例如分開液流的S形曲線或微柱，他們用超級計算機計算了每一個元素，以弄清它們如何改變流動。uFlow使用了這些數據，將每個元素的終點作為下一個的起點，從而在模擬複雜管道形狀時節約處理能力。

一旦得到了想要的晶元設計，科研人員便可以從幾種獲得晶元的方法中做出選擇。他們可以自己設計製作，也可以訂購定製晶元。就職於麻省總醫院的研究者 Shannon Stott和她的同事向日本電子巨頭索尼公司的一個分部（目前由德國Stratec公司所有）外包了製作過程，用索尼製作藍光光碟的機器來製作血液分選晶元。

還有一些標準微流控晶元可用於實現常用功能。供應商有很多：比較主流的選擇包括位於美國加州聖克拉拉的安捷倫科技公司； 位於英國羅伊斯頓的Dolomite公司；位於加州南舊金山的Fluidigm公司和前文所述的Fluigent公司。

要製作三維晶元，科學家們通常需要將聚合物層層堆疊在光刻模具中。然而，一種入門級晶元製作方法的設計者表示，3D列印正在改變這一狀況，因為它不需要太多專業知識或設備。荷蘭瓦赫寧根大學的化學家Vittorio Saggiomo在家中偶然萌生了這個想法。他 會3D列印塑料工具（比如小燈或者移液器支架）和有趣的東西（比如鳥窩）。有一天，他把一個3D列印的《星球大戰》頭盔浸入了丙酮溶液中，好讓頭盔表面更加光滑，但他放的時間太長，整個頭盔都被溶解了。他意識到，同樣的方法也可以用來塑造微管道。

Saggiomo和他同為化學家的同事Aldrik Velders將這個過程應用在了實驗室里。他們使用3D印表機製作出想要的管道形狀，讓塑料結構懸浮在PDMS。待固化後，再將其在丙酮中浸泡過夜以溶解塑料，最終得到立等可取的微晶元。Saggiomo和Velders正在使用這種方法製作螺旋管和交織的管道。其他方法很難製作這類結構：舉例來說，他們設計的一種晶元擁有一根被螺旋管道纏繞的直管道。Saggiomo說，使用者可以在螺旋管道里通熱液或冷液，從而在PCR等技術中改變樣品的溫度。

即使在標準製造流程中，晶元設計師也能使用諸如V型、角和蜿蜒曲線等管道設計來發揮創意。Di Carlo說，雖然這一領域已經開始了標準化設計的開發，但在設計多樣的流體通路方面仍有許多發揮的空間。

晶元設計師也在努力預測這一量級上的流體動力學。Elvesys創新中心（位於巴黎的一個微流體公司）的工程師Walter Minnella表示：「這個尺度下，（流體）的物理機制與浴缸里的水完全不同。」一些力，比如重力，變得可以忽略不計，而高表面積/體積比會產生表面張力，並對流體和管道壁面之間的相互作用產生極大的影響。Di Carlo說，水溶液會變得粘稠，就像蜂蜜，但沒有湍流。 因此，流體運動是可以預測的——但他估計可能仍然需要超級計算機算上一兩天才能解決，這就導致反覆模擬變得不那麼現實。大多數科學家選擇了經驗方法：構建，測試，再重複（參見「晶元設計技巧」）。

血液中細胞的分離

在定下目前的晶元設計前，麻省總醫院的機械工程師Shannon Stott和她的課題組製作了多個版本的晶元。他們研究的是液體活檢，一種根據血液中的遺傳線索檢測和診斷疾病的方法。他們的目標是開發一個可以從微創採集的血液樣本中分離和分析CTCs的系統。他們將晶元命名為CTC-iChip — i 代表「慣性聚焦」（inertial focusing ），研究者利用這種技術將細胞排成一行，從而把CTCs與其他血細胞分開（參見「晶元結構解析」部分）。除此之外，團隊還能利用這種晶元計數患者血液樣本中的CTCs，並研究其遺傳組成。

CTC-iChip由塑料製成，將三個階段整合到了一塊晶元中。在第一階段，晶元會去除掉不需要的血液成分。科學家用磁珠標記白細胞，然後讓液體流過配有一系列塑料微柱的腔室。紅細胞和蛋白質等尺寸較小的成分能穿過這些微柱，就像蛾子飛過茂密的森林一樣，而大一些的細胞，比如白細胞和稀有的CTCs則更像笨拙的大熊。它們被微柱彈離後，個大的細胞會沿著漏斗狀流道進入第二階段，即S型曲線流道，Stott將它們稱為「搖擺器」，其作用是將細胞排成一行。在第三階段，晶元用磁鐵吸引連接了磁珠的白細胞離開流線，從而留下CTCs。

Source: Ref. 4

Di Carlo的實驗室則開發了自己的微流體方法，以分類血樣成分。他們使用了配有一系列側室的管道，形狀如同教堂外部的十字形側翼走廊。他之前的學生SJ Claire Hur（現在是約翰·霍普金斯大學的機械工程師）注意到，較大的細胞會被捕獲在微流體通道拓寬形成的旋渦中，就像樹葉和垃圾圍繞河流拐彎處或河流中的岩石聚積一樣。他的團隊設計了一個系統，利用這一原理分離CTCs用於後續分析，該系統現在已由加州門洛帕克市的Vortex Biosciences公司批量生產。研究人員正在臨床研究中使用Vortex公司的產品，以識別CTCs中的標記物。這些標記物或許能揭示出腫瘤對特異性免疫療法的響應程度。

Di Carlo表示，這種「實驗室中的晶元」 通常就已經夠用了，它們仍然比常規方法更節約經費，還能儘可能減少實驗者的人為誤差，從而改進結果。 但是，一個真正的晶元實驗室設備將有能力在發展中國家的診所或野外工作站開展快速基因檢測。在這些地區，購買和使用PCR儀或離心機來分離血樣可能是不現實的。

真正的晶元實驗室還在路上

工程師已經想出了一系列可能的解決方案。舉例來說，一些人正在開發廉價的紙晶元，用於擴增和檢測血樣中傳染性微生物的基因。德國內恩的Hain Lifescience公司設計了可以檢測特定DNA序列的測試條。一種晶元可以通過搜索APOE基因突變來確定一個人患阿爾茨海默病的風險，另一種則能報告與強直性脊柱炎（一種侵犯脊柱的關節炎）相關的基因。

密歇根州立大學的環境工程師Syed Hashsham正在開發一種基於晶元的設備，以應用於癌症和傳染病領域的基因診斷。他表示：「我們必須簡化一切。」為了降低產品成本，並且讓野外科學家也能密封晶元，他放棄了在野外條件下難以封裝的硅基晶元，而選用了使用激光切割、薄膜封裝的塑料晶元。

另一個挑戰是如何在野外現場環境中擴增出稀少的遺傳物質，以達到能夠檢出的量。標準方法，也就是PCR，需要反覆加熱和冷卻樣品到精確的溫度。但設計出一種便攜、便宜、能夠在不同溫度間切換的小型設備並非易事，Hashsham說：「在野外，熱循環是行不通的。」

在他的手持式微流體設備「Gene-Z」中，他採用了另一種核酸擴增技術來識別和定量已知的基因序列，比如指示癌症的小分子核糖核酸（miRNA），或者傳染性有機體的基因。該技術被稱為環介導等溫擴增（LAMP）技術，使用的是與PCR反應不同的酶，而且不需要溫度循環。研究人員將體液樣本（如唾液）與熒光染料混合，熒光染料會與反應中產生的任意DNA結合，然後用注射器將混合物推入管道，管道連接著16個預先加入DNA擴增試劑、並晾乾備好的獨立儲液池。反應完成後，該設備會通過使用發光二極體和感測器來檢測熒光，以指示陽性反應。

Hashsham說，整個設備可由iPod Touch控制，而且製作成本不超過200美元。每個一次性晶元包括64個儲液池，總共可以測試四個樣品，成本低於一美元。他已經驗證了Gene-Z對100多種疾病的檢測結果。他表示，現在的挑戰在於說服投資人出資生產無法馬上獲利的設備，因為他希望將這一設備應用能通過快速診斷改變醫療過程、挽救生命的地區，比如非洲。

將科研想法轉化到商業世界確實很難——Shen也同意這種觀點。她還指出，公司或許不會投資太過昂貴，或者無法用現有的流水線生產的設計。這意味著，微流體系統距離晶元實驗室的理念還有很長的路要走。她說：「差距仍然存在，但我認為我們正在慢慢縮小這一差距。我們終將實現真正意義上的晶元實驗室。」

Naturedoi:10.1038/545511a

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