片段篩選中常犯的錯誤分析

作者:湯姆貓

An expert is a person who has made all the mistakes that can be made in a very narrow field. —— NielsBohr

前言

在藥物發現技術領域裡，唯一不變的就是不斷地變化！不斷革新的技術挑戰舊有的方法，有些方法很快的出現、成熟，然後被拋棄。二十年前，高通量篩選技術的出現，很快主導了先導物發現領域，很多製藥公司建立起了超過數百萬個分子的化合物庫，催生了很多新的先導物，尤其是對那些已知的藥物靶點，然而該技術在對一些未知的或研究還不透徹的靶點來說，效率不高，經常會產生假陽性現象，或者得到的先導物存在很多問題。隨著有機化學在新世紀的高速發展，估計具有類藥性的小分子化合物數量約有10^63億個，超過了宇宙里星星的數量，數百萬的化合物庫對於這樣龐大的數據來說，顯得還是太過單薄！

圖一 高通量篩選和片段化設計比較

由於高通量篩選存在的缺陷，基於片段的先導物發現技術(FBLD)被開發出來。FBLD採用了完全不同的策略，相比於高通量篩選數百萬個藥物大小分子量(重原子數一般在30左右)的化合物，FBLD以小分子化合物為起始點，通常分子量不超過300，重原子(非氫原子)數低於20，大約是藥物分子量的一半，因此，具有成藥性的片段化合物數量大大減少，Reymond課題組曾系統的計算過，對於含17個重原子的化合物，大約有1660億個具有成藥性的片段分子，和天文數字的類藥性分子相比，算是一個比較能接受的數據，因此，對於FBLD技術來講，只要有數千個片段的化合物庫，就能開展先導物的發現試驗，大大降低了先導物的發現難度和成本。在得到和靶點結合比較好的片段分子之後，通過對片段分子的不斷修飾，得到期望的備選藥物！在過去的近二十年里，基於片段的先導物發現技術(FBLD)在學術界和工業界得到了廣泛的應用，並且碩果累累，超過二十個臨床試驗期藥物的發現都是基礎此項技術，FBLD技術獲得了巨大的成功，目前已有有很多著作和文獻做過FBLD的綜述！

很明顯，FBLD技術是能夠有效地發現新的先導化合物，但是這個過程卻不像想像中那麼簡單，會有很多的陷阱和困難存在。首先要面對的就是如何準確無誤的得到能和靶點結合的化合物片段，因為片段通常和靶點的結合力都很弱，需要有很靈敏且可靠的檢測方式才行！

圖二 片段篩選技術

1996年，雅培公司的研究者證明了蛋白質探測NMR技術不僅可以探測到很低的片段與蛋白結合作用，還能發現片段連接方式，如今更多的探測方式被開發出來(圖二)，如表面等離子體共振技術(SPR)、配體核磁共振探測(NMR)、熱力學位移法等(Ts)。不同的方法有各自的優點和缺陷，對於一個經驗豐富的藥物設計專家來說，他能綜合各種技術的優缺點，準確地從雜訊中檢出信號峰，從而得到真正有用的片段。而對於新手來說，很容易會被雜訊峰干擾，得出錯誤的結論，產生假陽性的結果。更有甚者，研究者自己都未意識到判斷出錯，結果發表了錯誤的數據，而其他跟進者所做的工作，要麼不能重現，要麼也得到了錯誤的結論。

在片段化合物的發現過程中，每一步都可能出現錯誤，總體上可分為兩類：一類是片段化合物造成的，還有一類是檢測方式產生的。

1.化合物造成的誤差

正確的化合物

首先，要保證所用的化合物是正確的！雖然這個問題看起來太低級，但很多研究者都遇到過。產生這種錯誤的原因可能是化合物在資料庫註冊時出錯，也有可能是供應商出錯，造成拿到的化合物並不是期望使用的結構，這樣一般會產生兩種結果：第一、運氣好，初步的篩選成功了，但是後續的化學修飾總是失敗；第二、帶著錯誤一路成功下去，但是始終用著錯誤的結構。這樣的錯誤真實發生過，如很多研究者發現，他們從供應商那裡買到的伯舒替尼其實只是錯誤的異構體。

純度問題

通常片段篩選時的濃度都比較高，因此，即使小量的活性雜質也會對結果產生非常大的影響。以1mM的濃度進行篩選，假若含有1%的雜質，那麼雜質的濃度也會達到1uM。一般的雜質可以通過NMR和HPLC-MS檢測，但是合成過程中引入的金屬雜質用上述方法是無法發現的！銀、鋅、鈦、鈀等是合成化學中常用的金屬試劑，這些殘留的金屬雜質經常會造成假陽性結果，因此，在進行片段篩選時，一定要注意化合物是否達到合格純度。

圖三 發生降解的片段化合物

穩定性問題

一般藥物化學家都會盡量製備出能夠在外部穩定儲存的化合物作為備選片段，由於不當的存儲方式，某些化合物還是會發生降解反應，其中一個原因就是常用溶劑DMSO造成的。DMSO具有溫和的氧化性，嘧啶類衍生物在DMSO中就很容易發生降解反應。另外一個原因就是水！DMSO是一種吸濕性溶劑，在儲存時發生冰凍-溶解循環，導致某些化合物會發生水解反應。除了上述兩個原因外，光照、pH、溶液狀態等都可能導致化合物發生降解反應，因此在進行片段篩選的時候要關注所用化合物的穩定性如何，如果不穩定就修改實驗方案。

圖四 可形成共價鍵結合的官能團

反應活性化合物

有些化合物在體外是穩定的，可以長期儲存，但是具有較高的化學反應活性，容易和生物靶點生成共價鍵，形成不可逆的結合。當然了，有很多藥物是採用這種設計策略，對於非共價鍵結合藥物的設計時，要避免這些具有高度反應活性的官能團(圖四)，但對於共價鍵結合藥物的設計時，必須要仔細設計，高度反應活性容易引起嚴重的副反應，導致造成後期的開發的失敗。

圖五 容易產生假陽性的結構

假陽性化合物

大多數經驗豐富的藥物化學家在看到具有這些官能團的分子時(圖五)，都會非常小心。當然了，並不是所有看起來有問題的分子都會產生真正的問題，產生假陽性的化合物通常都會含有邁克受體結構，而蛋白質的氨基酸殘基中多含有親核部分，兩者容易發生反應，或許也會有非共價結合作用，但這種共價結合作用會極大地干擾實驗結果。此外這些結構也容易產生假陽性結果(圖五)，很不幸的是，此類化合物商業易得，很多化合物庫中都含有，而且經常表現出非常好的效果，有些研究者並不了解這些化合物本身具有的干擾性，發表的數據誤導了很多人。

圖六 氧化還原活性分子

氧化還原活性分子

有些化合物具有氧化還原循環特性，通常含有多個氮原子，在緩衝劑DTT或TCEP的作用下生成活性中間體，同時被空氣氧化，產生過氧化氫，進而氧化蛋白質，尤其是半胱氨酸殘基部分，但是這種機理很多人並不清楚，導致假陽性結果。如化合物11(圖七)，最初認為是一個蛋白-蛋白相互作用抑製劑，在後續的平行構效關係研究中，發現該化合物在緩衝劑DTT的作用下發生氧化-還原循環，產生過氧化氫造成陽性結果。

圖七 易聚合化合物

易聚合化合物

有些化合物在體外能夠穩定存在，且不存在高反應活性官能團，也可能會造成假陽性結果(圖八示例)，主要造成的原因是在緩衝溶液中產生了聚合現象，聚合生成的粒子能夠抑制很多不同種類的靶點，造成假陽性結果。聚合作用的發生和濃度密切相關，濃度越高，聚合作用越明顯，在進行片段篩選時呈現濃度正相關的陽性結果。因此在進行片段篩選時，要確定化合物是穩定的、不會發生聚合作用。

2.測試方式造成的誤差

除了片段化合物造成的錯誤結果外，不同的測試手段也有自身的優勢和缺陷(如表一)，因此，對於一個可能的有效的片段化合物，需要通過多種不同的測試手段，確定其效果。例如通過核磁共振和表面等離子體共振兩種手段會得到很多有效片段化合物，可兩種測試方式都顯陽性的化合物可能寥寥無幾，而晶體學測試後發現，沒有一個是有效的！

表一 各種篩選方法比較

核磁共振檢測法

核磁共振測試配體-蛋白相互作用是最早應用於片段化設計策略的檢測方式，可靠性和有效性都很不錯，但是仍然也有自身的缺陷。採用NMR檢測時，配體的數量是遠遠大於靶點蛋白的，如果配體從蛋白上解離的速率很慢，其凈效果就會很弱，甚至探測不到有結合的現象，造成假陰性結果！在實踐中，表現為低濃度的結合效率比高濃度的結合效率還要好些。另外，某些片段化合物溶液可能顯酸性或者鹼性，會導致pH的變化，也會引起蛋白化學位移的變動，干擾實驗結果。

X射線晶體學

有圖有真相，再多的語言描述，也比不過一張漂亮的單晶衍射照片！晶體數據被認為是黃金標準：通過晶體可以得知配體是如何和靶點相互作用，能夠給下一步化合物的修飾提供重要指導意義。但是我們都忽略的一點是：再漂亮的分子模型也只是一個模型而已，顯示的只是一個單一的靜態結構，並不能完全體現蛋白與配體在溶液中的相互作用關係，而且，有些時候會誤把緩衝物質或溶劑錯認為配體片段。最大的問題在於，由於蛋白-配體晶體培養時用了很高濃度的配體，所以拿到的晶體結構或許只是配體和蛋白的共結晶產物！而且，並不是所有的配體都能夠和蛋白形成可以用於測試的單晶結構，這也限制了X射線晶體法在片段篩選中的應用。

等溫滴定量熱法(ITC)

ITC測量可以提供配體-蛋白的結合熱力學參數(ΔG, ΔH,ΔS)，在精確操作的前提下，這個方法是非常有效和可靠的，但該方法容易受到系統誤差的影響，如不正確的測試濃度和不能合適計量的稀釋熱等。對於同樣的測試項目，不同實驗室可能會給出不同的測試結果，ITC方法還需要進一步的發展。

表面等離子體共振法(SPR)

目前SPR技術在片段發現領域占支配地位(圖二)！首先把蛋白負載在一張晶元上，然後讓不同濃度的小分子化合物溶液流過，當配體和蛋白結合後，會導致配體質量和蛋白質量的變化，通過檢測這種微小的比例變化尋找配體。SPR技術容易操作，但想要得到穩定可靠的數據，有很多需要注意的地方，聚合作用是影響SPR技術的一個因素，會導致出現SPR信號，對於缺乏經驗的研究者會誤以為是配體結合到了蛋白上。再比如負電性蛋白會吸附正電性的配體，而這種吸附作用是沒有特異性的，也會出現假陽性結果！

熱位移法

熱位移法是指將配體和蛋白混合之後加熱，然後測量蛋白質的「溶解溫度」，通常配體能夠穩定蛋白質，如果發現「溶解溫度」升高，就意味著該配體能夠和蛋白結合，這種方法簡單有效而且便宜，在片段篩選上運用很廣泛。

結語

在片段篩選的過程，每一步都可能得到錯誤的信息，了解這些可能存在的原因能夠避免重複別人的錯誤，提高開發效率，同時也能夠避免不必要的資源浪費！

參考文獻：

1.Davis，Ben，and Daniel A. Erlanson. "Learning from our mistakes: The "unknown knowns" in fragment screening." Bioorganic& Medicinal Chemistry Letters 23.10 (2013): 2844-2852.

2.Erlanson，Daniel A，etal. "Twenty years on: the impact of fragments on drug discovery.." Nature Reviews Drug Discovery 15.9 (2016): 605-619.

3.Baell，Jonathan B.."Broad coverage of commercially available lead-like screening space with fewer than 350,000 compounds." Journal of Chemical Information and Modeling 53.1 (2013): 39-55.

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