神仙打架：LncRNA Xist調節X染色體沉默新機制的發現與爭論

BioArt按：在生命科學領域，發生學術爭議是一件稀鬆平常的事情。面對某一項研究成果引來的爭議或者說質疑，小同行之間處理的方式卻是有多種，有表面上一團和氣卻私底下破口大罵的、有在某些重大會議期間學祥林嫂的、還有得學紅學索隱派的那一套搞影射的，然而這些終究上不得檯面，也絕對不是主流了。當然，最科學的方式就是在專業權威雜誌上有針對性的回應，可以單純從理論上解釋，也可以拿一些實驗證據出來反駁，如此這般，科學才會越較越真，最終成為顛撲不破的真理。近日，Sceince雜誌上公開了一幕非常有趣而且火藥味十足的學術爭議。這個故事講的是來自加州理工學術新星Mitch Guttman（曾入選《福布斯》評選的 "30 Under 30: Science and Healthcare" 名單，Eric Lander的得意門生）去年在Science上發表文章聲稱發現了lncRNAXist引發X全染色體沉默的新機制，而這篇文章發表之後便引起了這個領域的重量級人物Jeannie T. Lee（哈佛醫學院教授、美國科學院院士、HHMI研究員）的回應文章，直言Mitch Guttman去年的Science文章結論不對。當然，Mitch Guttman也不甘示弱，同樣在Science上發表文章回擊。具體過程究竟如何呢？詳見正文部分的印第安納大學醫學院程偉博士帶來的精彩解讀。

2016年Mitch Guttman課題組的論文

撰文丨程偉（印第安納大學醫學院博後）

人類基因組計劃的啟動為生物學研究帶來了不可估量的長遠影響。從早期的全基因組DNA測序到後來的全基因組染色體免疫共沉澱測序(ChIP-seq)再到最新的各種RNA表達譜測序不僅為生物學提供了前所未有的海量生物學數據也揭示了許多新的基因表達調節機制。長非編碼RNA (Long noncoding RNA，lncRNA)便是由測序技術重新發現的一種基因表達調節機制。全基因組表達譜測序技術發現人類細胞超過97%的基因組處於活性轉錄的狀態，其中大部分的基因都沒有編碼活性。而這些非編碼的RNA可以作為功能單位調節基因的表達。

實際上在測序技術出現之前，某些lncRNA作為個例已有研究。其中研究最深入，機制最清楚的lncRNA就是X-inactive specific transcript （Xist）。眾所周知，雌性哺乳動物擁有一對X染色體。為了抑制一對X染色體同時激活而導致劑量效應，其中1條X染色體會被整體沉默。研究發現待沉默的X染色體在其中名為X inactivation center (XIC)的區域轉錄出Xist，Xist進而覆蓋擴散至全X染色體實現全X染色體的基因沉默。 Xist的敲除可以直接導致X染色體沉默失敗，而將其轉移到其他染色體也可以導致該染色體沉默。這些證據揭示了儘管Xist不能編碼蛋白，但依然可以在RNA層面發揮功能調節基因表達。而最新的高通量測序結果表明lncRNA調節基因表達並非是僅在Xist等少數lncRNA中存在的特殊機制，而是作為一個基礎性的機制參與眾多基因的表達調控。

研究核心內容簡介

Xist在X染色體沉默中的核心功能已經十分清楚，但其引發X全染色體沉默的機制卻並不完全清楚。Caltech的Mitchell Guttman課題組前期利用質譜技術發現Xist可以和Lamin B Receptor(LBR)相互作用，但這種結合的意義未知。LBR作為細胞核內膜蛋白通過控制染色質在細胞核內的錨定而參與了染色體三維結構（3-dimensional structure of chromosome）的建立。鑒於染色體三維結構參與了基因的表達調控而沉默X染色體定位細胞核lamina，本項研究假設Xist與LBR的結合引發了X染色體三維結構的改變從而參與了X染色體的沉默。

作者利用CLIP-seq（cross-linking immunoprecipitation sequencing）技術對這一假設展開驗證。CLIP作為一種檢測蛋白-RNA相互作用的新方法，主要優勢在於其能夠精確定位RNA中與特定蛋白的結合序列。本項研究利用該方法將Xist上與Lamin B Receptor(LBR)結合的區域定位到3段區域 （下圖A, LBS-1, LBS-2 and LBS-3）。作者利用CRISPR對其中一段結合區域（LBS-1）的一部分進行了刪除並構建了穩定細胞系ΔLBS-Xist（ΔLBS,下圖A, bottom panel），這一刪除並不影響Xist與SHARP蛋白相互作用 （SHARP已被證明參與了Xist介導的X染色體沉默）而僅特異性的降低了Xist與LBR相互作用 （下圖B）， X染色體上標誌基因Atrx表達也隨之激活（下圖C）。為了進一步證明Xist該區域與LBR相互作用對X染色體沉默的調節活性，作者引入了一個人工相互作用系統促進ΔLBS-Xist和LBR的重新結合。他們將viral BoxB RNA aptamer 的DNA序列利用CRISPR技術特異性的敲入到ΔLBS-Xist穩定細胞系中ΔLBS區域，構建了ΔLBS-Xist-BoxB 穩定細胞株。隨著轉入外源的LaminB1-λN fusion protein，ΔLBS-Xist便可通過其上的外源BoxB RNA序列與λN fusion protein的特異結合而重新與LBR結合。而這種結合成功挽救了Xist的抑制活性（下圖D）。

為了進一步尋找Xist通過LBR所控制的X染色體區域，作者又引入了RNA Antisense Purification sequencing (RAP-seq)技術。該項技術利用Biotin等標記的RNA 反義序列與RNA的結合來釣取與RNA相互作用的DNA序列。RAP的結果顯示ΔLBS-Xist細胞中Xist與X染色體的大量區域失去了相互作用 （見下圖）。綜合這些證據，作者提出了一個Xist調節X染色體沉默的新機制，即Xist通過招募LBR來調控X染色體的三維結構從而促進X染色體的抑制。

爭論

本文發表後，Science雜誌社便收到了Xist領域核心人物美國科學院院士Jeannie T. Lee的評論（下圖），Lee課題組通過對RAP和CLIP原始測序數據的分析完全推翻了本項研究的結論（原文「These inconsistencies preclude assessment of the role of LBR in Xist spreading」）。

Jeannie T. Lee，HHMI研究員、美國科學院院士、哈佛醫學院教授

爭論的焦點主要集中在四個方面：

1. Lee認為本項研究所發現的Xist與LBR結合的特異性區域ΔLBS與他們之前所發現的ΔF區域幾乎完全重合。而在他們的研究中，該段ΔF區域對於Xist參與nucleation center的建立非常關鍵。作為X染色體沉默起始階段的關鍵一步，Xist的nucleation直接引發後期X染色體沉默的全染色體擴散。因而本項研究中ΔLBS所引發的X染色體沉默失敗的機制在於nucleation的失敗及其引發的次級效應，而並非由於與LBR的結合失敗。

2. 在比對本項研究的RAP原始測序數據發現，本項研究聲稱的ΔLBS-Xist及ΔLBS-Xist-BoxB穩定細胞系中依然可以檢測到本該被刪除的LBS區域的序列信號，並且與刪除序列附近的序列信號強度類似，因而此兩種細胞系中LBS區域並未刪除成功。而對這些LBS區域內的序列分析發現，LBS的序列與野生型的序列方向相反，這就意味著CRISPR並未導致LBS的刪除，而是導致了LBS序列的反向重新插入。除此以外，LBS的刪除理論上應該導致其兩側序列在ΔLBS-Xist變體中發生融合。奇怪的是，在CLIP測序的原始數據的分析發現LBS兩側序列並沒有檢測到新的融合序列。RAP與CLIP相互矛盾的原始數據表明本項研究Xist變體的穩定細胞系構建是失敗的。

3. 除去ΔLBS-Xist及ΔLBS-Xist-BoxB兩個關鍵細胞系外，Jeannie T. Lee認為本項研究的其它輔助變體細胞系的構建也並不成功。對這些細胞系的RAP測序原始數據的分析發現，各細胞系的RAP測序深度並不一致。例如野生型細胞株和ΔLBS細胞株的測序深度遠高於其他Xist突變細胞株，因而這兩株細胞也獲得了遠高於其他輔助細胞系的測序信號讀數，因此其他輔助細胞系中出現的數值降低也源自測序深度不夠，而並非真實的下降。Jeannie T. Lee認為本項研究通過不恰當的normalization（without appropriate normalization）誤導了作者（「The low sequencing depth and poorer-quality reads could have misled the authors to conclude that DLBS, DA, and LBR KD failed to spread Xist.」）。而對原始測序數據重新normalization後發現，包括ΔLBS及其他Xist突變細胞株在內的所有突變細胞系之間Xist與X染色體結合併沒有差別。

4. 在本項研究中使用了一株ΔA-Xist變體的突變細胞株作為陽性對照，該細胞的RAP測序結果表明，Xist的A區域也並未成功敲除，依然可以在原始測序數據中發現該區域的測序信號。而在CLIP的測序結果中，Xist的信號卻是完整的並沒有缺少A區域，這表明CLIP實驗中所使用的ΔA-Xist很可能是一株ΔA-Xist transgenic細胞系。

Mitch Guttman的回應

Mitch Guttman，加州理工學院生物工程與生物學系助理教授

作為本項研究的負責人，Caltech的Mitchell Guttman是美國基因組學冉冉升起的重量級新星。他對Jeannie T. Lee的評論也撰寫了回應（下圖）。

首先他提供了ΔLBS-Xist細胞系更詳細的genotyping原始PCR圖譜和測序結果。除了DNA水平以外，他們還設計了針對LBS區域的qPCR及RNA-FISH實驗來證明ΔLBS-Xist突變細胞系中的Xist RNA也是缺少LBS區域的。綜合這些證據他們認為自己的ΔLBS-Xist突變細胞系中LBS區域是成功刪除了的。

對於Lee提到RAP測序原始數據中出現LBS區域的信號，Guttman認為這部分信號實際上來源於RAP實驗中所使用的外源反義DNA引物。而這也剛好解釋了為何Lee發現這些序列是反向的。並且序列比對發現LBS區域中出現的信號恰好分布於RAP實驗中所使用的引物序列中。所以LBS區域並沒有發生Lee所謂的反向重新插入（inversion），這些出現的異常信號實則來自於引物序列。此外Lee聲稱沒有發現ΔLBS-Xist細胞中LBS兩側區域的融合序列，然而實際上這種融合序列在原始數據中是存在的。並且數量和Xist其他區域的平均值相當。這也進一步證明ΔLBS-Xist細胞的構建是成功的。

Mitchell Guttman還對Lee提到的測序深度及normalization進行了回應。他對各細胞的測序讀數數量和表型進行了比較，發現它們之間沒有對應關係。此外Lee在normalization過程中並沒有將RAP所用到的反義引物序列所產生的信號排除在外，所以Lee的normalization方法也並不正確。

綜合這些證據，Guttman認為他們的ΔLBS-Xist突變細胞株的構建是成功的。最後對於Lee提到的LBS區域刪除其實是通過nucleation 失敗影響X沉默的假設Guttman也表示並不認同。他引用了數篇之前的報道。在這些報道中，該區域的刪除並不能導致nucleation失敗，因而LBS區域刪除導致nucleation 失敗的結論也並不一定正確。

評：「樓上」回應是應對學術爭議非常君子的做法，質疑方與被質疑方看上去都是用證據來說話，儘管一時間大家互相都說服不了對方，但是重要的學術成果一定是要最終經過學術共同體的認可才能慢慢被大家接受的。學術界其實非常需要這些理性的學術爭論，因為在大多數情況下當事人更多的是在私底下發表意見訴苦或者不屑，為了面子或者顧忌權威不大願意公開對某一成果提出不同的看法。

參考文獻：

1、Chen, C. K., Blanco, M., Jackson, C., Aznauryan, E., Ollikainen, N., Surka, C., ... & Guttman, M. (2016). Xist recruits the X chromosome to the nuclear lamina to enable chromosome-wide silencing.Science, 354(6311), 468-472.

2、Wang, C. Y., Froberg, J. E., Blum, R., Jeon, Y., & Lee, J. T. (2017). Comment on 「Xist recruits the X chromosome to the nuclear lamina to enable chromosome-wide silencing」.Science, 356(6343), eaal4976.

3、Chen, C. K., Chow, A., Lai, M., & Guttman, M. (2017). Response to Comment on 「Xist recruits the X chromosome to the nuclear lamina to enable chromosome-wide silencing」.Science, 356(6343), eaam5439.

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