7月份Nature、Science關注CRISPR/Cas重大突破

基因組編輯技術CRISPR/Cas9被《科學》雜誌列為2013年年度十大科技進展之一，受到人們的高度重視。CRISPR是規律間隔性成簇短迴文重複序列的簡稱，Cas是CRISPR相關蛋白的簡稱。CRISPR/Cas最初是在細菌體內發現的，是細菌用來識別和摧毀抗噬菌體和其他病原體入侵的防禦系統。

即將過去的7月份，有哪些重大的CRISPR/Cas研究或發現呢？小編梳理了一下這個月生物谷報道的CRISPR/Cas研究方面的新聞，供大家閱讀。

1.Science：從結構上揭示CRISPR/Cas系統的Cas1-Cas2整合酶發現靶DNA機制

doi:10.1126/science.aao0679

蛋白IHF（藍色）在CRISPR短迴文重複序列的上游產生一種個急轉彎，從而允許Cas1-Cas2（綠色和黃色）識別和結合插入位點。圖片來自Addison Wright, UC Berkeley。

CRISPR/Cas系統是在很多細菌中發現的一種免疫系統。在細菌中，這種系統依賴Cas1-Cas2整合酶捕獲和整合短的外源DNA片段到它們的基因組中的CRISPR位點上，從而能夠抵抗相同病毒的再次入侵。

在一項新的研究中，來自美國加州大學伯克利分校的研究人員發現Cas1-Cas2如何找出它們將病毒DNA片段插入到細菌基因組中的這個位點，這樣Cas1-Cas2隨後就能夠識別這種病毒DNA片段和發起攻擊。相關研究結果於2017年7月20日在線發表在Science期刊上，論文標題為「Structures of the CRISPR genome integration complex」。

論文通信作者Jennifer Doudna和她的研究團隊利用電子顯微技術和X射線晶體分析技術捕獲到Cas1-Cas2將病毒DNA片段插入到細菌基因組的CRISPR區域中時的結構圖。

這些結構圖揭示出第三種蛋白IHF（在Cas1-Cas2整合酶中，Cas1是第一種蛋白，Cas2是第二種蛋白）結合到這個插入位點的附近，讓靶DNA彎曲成一種U形結構，從而允許Cas1-Cas2同時結合到靶DNA的兩個末端上。

2.Nature：利用體內CRISPR-Cas9篩選技術發現新的藥物靶標來增強癌症免疫療法

doi:10.1038/nature23270

在一項新的研究中，來自美國達納-法伯癌症研究所和波士頓兒童醫院癌症與血液疾病中心等研究機構的研究人員開發出一種新的篩查方法，即利用CRISPR-Cas9基因組編輯技術在小鼠體內測試上千個腫瘤基因的功能。他們利用這種方法揭示出新的藥物靶標，從而可能潛在地改進PD-1檢查點抑製劑（一類新的有前景的癌症免疫療法）的療效。相關研究結果於2017年7月19日在線發表在Nature期刊上，論文標題為「In vivo CRISPR screening identifies Ptpn2 as a cancer immunotherapy target」。論文通信作者為小兒科腫瘤學家W. Nick Haining博士。

論文第一作者、Haining實驗室研究生Robert Manguso設計出一種基因篩選系統來鑒定癌細胞用來躲避免疫攻擊的基因。他利用CRISPR-Cas9系統性地敲除黑色素瘤（一種皮膚癌）細胞表達的2368個基因。CRISPR-Cas9像一把分子剪刀那樣發揮作用，在遺傳密碼的特定位點準確地切割DNA。Manguso隨後能夠鑒定出哪些基因當被剔除時會使得這些癌細胞對PD-1阻斷更加敏感。

通過注射這些腫瘤細胞到小鼠體內和利用PD-1檢查點抑製劑治療這些小鼠，Manguso隨後能夠統計哪些接受編程的腫瘤細胞存活下來。那些死掉的腫瘤細胞因發生基因缺失而對PD-1阻斷敏感。 利用這種方法，Manguso和Haining首次證實了已知的兩種免疫逃避基因（PD-L1和CD47）的作用，靶向它們的抑製劑藥物已用於臨床試驗中。他們隨後發現許多新的免疫逃避基因，如果通過治療手段加以抑制，就能夠改進PD-1癌症免疫療法。特別令人關注的是，其中的一個新發現的基因是Ptpn2。

3.Nature：重大突破！發現III型CRISPR-Cas系統新的作用機制

doi:10.1038/nature23467

在一項新的研究中，瑞士蘇黎世大學的Martin Jinek領導的一個國際研究團隊史無前例地發現細菌保護自己免受侵入性病毒攻擊的一種新的防禦機制。當遭受入侵時，作為細菌免疫系統的CRISPR-Cas系統產生一種化學信號來激活第二種酶，從而協助降解這些入侵者的遺傳物質。這一過程非常類似於人先天性免疫系統的一種抗病毒機制。相關研究結果於2017年7月19日在線發表在Nature期刊上，論文標題為「Type III CRISPR–Cas systems produce cyclic oligoadenylate second messengers」。

CRISPR-Cas系統的這種靶向複合物由源自規律間隔性成簇短迴文重複序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR）的RNA序列（即crRNA）和CRISPR相關蛋白（CRISPR-associated proteins, Cas）組成。crRNA識別入侵性病毒的遺傳物質，而Cas蛋白像一把分子剪刀那樣切割它。在CRISPR-Cas系統的一個亞型（被稱作III型CRISPR-Cas系統）中，該團隊取得一項令人吃驚的發現。當這種靶向複合物識別入侵性病毒時，它合成「第二種信使」：一種小的環狀RNA分子，即環寡腺苷酸（cyclic oligoadenylate）。這種信號分子能夠在細菌細胞內擴散，激活另一種被稱作Csm6的RNA降解酶，這種RNA降解酶協助破壞這種病毒的RNA。

4.Blood：利用CRISPR引入有益的血紅蛋白突變，有望治療危及生命的血液疾病

doi:10.1182/blood-2017-02-767400

圖片來自CC0 Public Domain

在一項新的研究中，來自澳大利亞新南威爾士大學、日本理化學研究所生物資源中心和日本紅十字會的研究人員利用基因編輯技術CRISPR將一種有益的自然突變引入到血細胞中，能夠開啟胎兒血紅蛋白（foetal haemoglobin）產生，這一進展可能最終導致人們開發出治癒鐮狀細胞性貧血和其他的血液疾病的方法。相關研究結果於2017年7月18日在線發表在Blood期刊上，論文標題為「KLF1 drives the expression of fetal hemoglobin in British HPFH」。

作為一種至關重要的分子，成人血紅蛋白在肺部獲得氧氣，將它運送到全身各處。地中海貧血或鐮狀細胞性貧血患者具有缺陷性的成人血紅蛋白（adult haemoglobin），因而他們需要終生接受血液灌注和藥物治療。然而，患有這些疾病的病人如果也攜帶一種有益的被稱作British-198的自然突變，那麼他們具有減少的癥狀，這是因為這種突變開啟正常情形下在出生後就會被關閉的胎兒血紅蛋白產生。

論文通信作者、新南威爾士大學分子生物學教授Merlin Crossley說，「利用CRISPR基因編輯技術，我們如今能夠準確地切割和改變我們的巨大的基因組內的單個基因。我們的實驗室證實利用這種技術將這種有益突變British-198引入到血細胞中可顯著地提高它們的胎兒血紅蛋白產生。」

5.Nat Med：利用CRISPR/Cas9恢復肌肉功能

doi:10.1038/nm.4367

在一項新的研究中，研究人員利用CRISPR在小鼠體內成功地治療一種被稱作先天性肌營養不良1A型（congenital muscular dystrophy type 1A, MDC1A）的罕見疾病。這種疾病能夠導致嚴重的肌肉萎縮和癱瘓。他們能夠通過校正一種導致這種疾病的剪接位點突變恢復了這些小鼠的肌肉功能。相關研究結果於2017年7月17日在線發表在Nature Medicine期刊上，論文標題為「Correction of a splicing defect in a mouse model of congenital muscular dystrophy type 1A using a homology-directed-repair-independent mechanism」。

加拿大多倫多病童醫院研究員Dwi Kemaladewi在一項聲明中解釋道，「我們利用CRISPR切割兩個關鍵位點上的DNA，而不是插入已得到校正的DNA片段。這會導致基因的兩個末端一起恢復原狀，從而產生一個正常的剪接位點。」

通過靶向骨骼肌和外周神經，這些研究人員能夠改善這些小鼠的運動功能和移動能力。Kemaladewi在一份新聞稿中說道，「這是比較重要的，這是因為開發治療肌營養不良的策略主要集中在改善這些肌肉性能。專家們知道外周神經是較為重要的，但是骨骼肌被認為是導致MDC1A的元兇，而且傳統上是開發治療方案的重點。」

6.Science子刊：利用抗CRISPR蛋白顯著降低CRISPR-Cas9脫靶效應

doi:10.1126/sciadv.1701620

圖片來自Fuguo Jiang/UC Berkeley.

如今有研究證實病毒進化出的反制措施，即被稱作抗CRISPR蛋白（anti-CRISPR）的抑制性蛋白，能夠被用來改進作為一種基因治療工具的CRISPR-Cas9，從而降低可能導致不良副作用的脫靶基因編輯。

在一項新的研究中，來自美國加州大學伯克利分校和加州大學舊金山分校的研究人員證實最近發現的抗CRISPR蛋白降低脫靶效應多達4倍，就像一種切斷開關那樣讓CRISPR-Cas9完成它的任務之後失去功能。相關研究結果發表在2017年7月12日的Science Advances期刊上，論文標題為「Disabling Cas9 by an anti-CRISPR DNA mimic」。論文通信作者為加州大學伯克利分校創新基因組學研究所研究員Jacob Corn博士和來自加州大學伯克利分校的作為CRISPR-Cas9基因編輯發明人之一的Jennifer A. Doudna。

在這項研究中，這些研究人員讓CRISPR-Cas9分子利用嚮導RNA（gRNA）發現、切割和替換導致鐮狀細胞疾病的血紅蛋白編碼基因突變體。他們證實一種被稱作AcrIIA4的特定抗CRISPR蛋白將這種CRISPR-Cas9分子的脫靶效應降低4倍。它在做到這一點的同時不會顯著地降低想要的在靶基因編輯。

7.Nature：重磅！利用CRISPR–Cas系統將數字視頻存儲到一群細菌的基因組中

doi:10.1038/nature23017

如今，在一項新的研究中，Church團隊在基礎的概念驗證實驗中證實CRISPR系統能夠編碼與人類數字化視頻一樣複雜的信息，這就讓人想起早期的人類在洞穴壁表面上繪製的一些圖畫。他們在活細胞中編碼了一部視頻短片，該短片的內容是一個人騎著馬狂奔時的場景。相關研究結果於2017年7月12日在線發表在Nature期刊上，論文標題為「CRISPR–Cas encoding of a digital movie into the genomes of a population of living bacteria」。

CRISPR系統有助細菌在它們的不同環境中對持續的病毒攻擊產生免疫力。作為在感染中存活下來的記憶，這些細菌捕獲病毒DNA分子，利用它們產生短的所謂的「間隔」序列，並且將這些間隔序列作為新的序列元件添加到不斷增加的位於細菌基因組中的CRISPR陣列內。到目前為止，當相同的病毒再次入侵時，CRISPR-Cas9蛋白持續地利用這些間隔序列摧毀它們。然而，除了在基因組工程工具中廣泛使用的Cas9之外，CRISPR系統的其他部分迄今為止並沒有在技術上得到太多的利用。

Church說，「在這項研究中，我們證實我們將CRISPR系統的兩種蛋白Cas1和Cas2設計為一種分子記錄工具，而且隨著對最佳的間隔序列的序列需求獲得的新認識，這種分子記錄工具能夠顯著地擴大獲得記憶（即能夠由研究人員從外面提供的或者在未來可能由來自細胞的自然經歷形成的信息）和在基因組中儲存它們的潛力。通過進一步使用，這種方法可能給天然的組織環境中的不同活細胞類型提供線索，從而將它們正在經歷的變化記錄在它們的基因組上系統性構建的存儲熱點中。」

為了在更大規模上著手處理複雜信息，Church團隊求助於靜止圖片和移動圖片，這是因為它們代表著約束的明確定義的數據集，而視頻讓細菌有機會獲得按照時間順序發生逐幀變化的信息。論文第一作者Seth Shipman說，「我們設計出策略，將一張圖片或一幀的每個像素中含有的數字信息和幀編號轉化為DNA密碼，並且將這種密碼與其他的序列一起整合到間隔序列中。我們隨後將針對按照時間順序排列的連續幀設計的間隔序列集合提供給一群細菌，並且是利用Cas1/Cas2活性將這種間隔序列集合添加到它們的基因組中的CRISPR陣列上。在利用DNA測序再次取回來自這種細菌群體中的所有CRISPR陣列之後，我們最終能夠重建一個人騎著馬狂奔視頻短片的所有幀，並且是按照這些幀出現的順序進行重建。」

8.Nature：從結構上揭示CRISPR-Cpf1的DNA靶向機制

doi:10.1038/nature22398

圖片來自University of Copenhagen。

在一項新的研究中，來自丹麥哥本哈根大學的研究人員發現了一種新的被稱作Cpf1的分子剪刀如何讓DNA解鏈，並對它進行切割。這個CRISPR-Cas家族成員表現出較高的準確性，能夠像全球定位系統（GPS）那樣發揮作用以便鑒定出基因組中的靶位點。Cpf1的高精準度將會改進這種技術在修復基因損傷、其他醫學應用和生物技術應用上的使用。

這些研究人員成功地可視化觀察和描述了Cpf1的工作方式。這種蛋白屬於Cas家族，能夠切割雙鏈DNA，因而允許啟動這種基因組修飾過程。相關研究結果發表在2017年6月22日的Nature期刊上，論文標題為「Structure of the Cpf1 endonuclease R-loop complex after target DNA cleavage」。論文通信作者為哥本哈根大學研究員Guillermo Montoya和Stefano Stella。

全世界的科學家們正在努力優化這種基因組編輯技術以便讓它變得更加精準和更加高效。為了實現這一點，科學家們也關注特異性地切割DNA的其他蛋白，如Cpf1，對這些蛋白進行操縱能夠將它們引導到基因組中的特定位點上。Montoya團隊利用X射線衍射晶體分析技術成功地解析出控制這種過程的分子機制。

Montoya說，「我們利用X射線照射Cpf1蛋白晶體，能夠在原子解析度上觀察到它的結構，從而能夠讓我們觀察它的所有組分。X射線衍射是被用來解析生物分子結構的主要生物物理學技術之一。」

9.Cell：重磅！科學家開發出基於CRISPR的新技術 或有望開發更為安全的基因編輯療法

doi:10.1016/j.cell.2017.05.044

日前，一項刊登在國際著名雜誌Cell上的一篇研究報告中，來自美國德克薩斯大學（The University of Texas）的研究人員通過研究利用CRISPR開發出了新型的基因編輯療法來治療危及生命的疾病，比如癌症、HIV和亨廷頓氏症等。

文章中，研究人員開發了一種新方法，其能夠通過個體的完整基因組來快速檢測CRISPR分子，從而預見除了CRISPR的靶點外其是否還能夠同其它DNA片段相互作用，這種新方法或許就能夠幫助臨床醫生為患者制定個體化的基因療法，同時還能夠保證療法的安全性和有效性。Ilya Finkelstein教授說道，你和我之間或許會出現大約100萬個點的差異，由於這種遺傳多樣性的存在，對人類基因的編輯似乎總是一種需要進行定製化的療法。

研究人員就採用了一種DIY的方法來開發新型設備和軟體，他們利用當前的實驗室技術開發出了名為CHAMP的技術平台（Chip Hybridized Affinity Mapping Platform，音譯：晶元雜交親和映射平台），這項檢測的核心就在於其是能夠用於研究和醫學中的新一代標準化的基因測序晶元，其中還有兩個關鍵元件也是開放源，即能夠在顯微鏡下抓住晶元的3-D列印底板和用於分析結果的軟體，因此，其它研究人員就能夠在實驗室中輕鬆複製出設計CRISPR的技術。

10.Cell：重大突破！首次從結構上揭示CRISPR-Cas3系統作用機制

doi:10.1016/j.cell.2017.06.012

在一項新的研究中，來自美國哈佛醫學院和康奈爾大學的研究人員獲得來自嗜熱裂孢菌（Thermobifida fusca）的I型CRISPR複合體的近原子解析度的圖片，揭示出它的作用機制的關鍵步驟。這些發現提供改善CRISPR在生物醫學應用時的效率和準確性所需的結構數據。相關研究結果發表在2017年6月29日的Cell期刊上，論文標題為「Structure Basis for Directional R-loop Formation and Substrate Handover Mechanisms in Type I CRISPR-Cas System」。論文通信作者為哈佛醫學院細胞生物徐助理教授Maofu Liao和康奈爾大學研究員Ailong Ke。

這些研究人員利用冷凍電子顯微鏡技術首次描述出當這種CRISPR複合體裝載靶DNA並讓它做好被Cas3酶切割的準備時準確發生的一系列事件。他們說，這些結構揭示出一種存在多層錯誤檢測的過程，即存在阻止不想要的基因組損傷的分子冗餘（molecular redundancy）。

為了更好地理解CRISPR-Cas如何發揮功能，Liao、Ke和他們的團隊著重關注細菌中最常見的CRISPR亞型：1型CRISPR，即利用一種被稱作CRISPR Cascade的核糖蛋白複合體（riboprotein complex）捕獲DNA，並且利用酶Cas3切割外源DNA。

通過聯合使用生化技術和冷凍電子顯微鏡技術，他們復原出在不同的功能狀態下的穩定的Cascade，並且進一步獲得Cascade在捕獲和加工DNA時解析度低至3.3埃（大約是一個碳原子直徑的3倍）的圖片。

在CRISPR-Cas3中，crRNA被裝載到CRISPR Cascade上，隨後尋找一段非常短的表明外源病毒DNA存在的DNA序列（被稱作PAM）。

Liao、Ke和他們的同事們發現當Cascade檢測PAM序列時，它讓DNA呈銳角彎曲，迫使一小段DNA解鏈。這允許crRNA的一個長11nt的片段結合到靶DNA鏈上，形成一種「種泡（seed bubble）」。

這種種泡發揮一種自動防故障裝置的作用，檢查靶DNA是否匹配crRNA。如果它們正確地匹配，那麼這種種泡就會擴大，crRNA的剩餘部分就與它對應的靶DNA結合，形成一種「R環（R-loop）」結構。

一旦這種R環完全形成，這種CRISPR Cascade複合體經歷一種構象變化，從而將靶DNA鎖定。它也讓DNA的第二條非靶標鏈產生一個凸起，這個凸起被移交到這種CRISPR Cascade複合體的一個不同位置上供Cas3酶切割。

僅當一種完整的R環形成時，Cas3酶才結合和切割在這條非靶標DNA鏈上產生的這個凸起上的DNA。

這些發現揭示出一種精心設計的分子冗餘確保精準切割和避免錯誤地切割細菌自己的DNA。

11.Nat Commun：利用CRISPR-Cas9阻止視網膜中的血管生成，有望治療多種眼部疾病

doi:10.1038/s41467-017-00140-3

圖片來自Thomas Splettstoesser (Wikipedia, CC BY-SA 4.0)

血管生成（angiogenesis）導致視力喪失和失明，是增殖性糖尿病視網膜病變（proliferative diabetic retinopathy, PDR）、濕性年齡相關性黃斑變性（Wet age-related macular degeneration, AMD）和早產兒視網膜病變（retinopathy of prematurity, ROP）等幾種退行性眼部疾病的一種特徵。

在一項新的研究中，來自美國麻省眼耳醫院斯格本斯眼科研究所的研究人員利用基因編輯技術CRISPR-Cas9成功地阻止視網膜中的血管生成，這可能導致人們為以病理性眼球內血管生成為特徵的眼部疾病開發出新的療法。相關研究結果於2017年7月24日在線發表在Nature Communications期刊上，論文標題為「Genome editing abrogates angiogenesis in vivo」。

這些研究人員利用腺相關病毒（AAV）運送靶向VEGFR2的CRISPR-Cas9系統。VEGFR2是導致血管生成的一種至關重要的蛋白。單次注射這種系統能夠阻止臨床前模型中的視網膜血管生成。

12.Mol Cell：CRISPR靶向序列文庫增強這種基因編輯方法的力量

doi:10.1016/j.molcel.2017.06.030

作為一種在生物學中比較流行的基因編輯技術，CRISPR如今比以前任何時候都要更強大。在一項新的研究中，英國研究人員構建出一種能夠被用來引導CRISPR-Cas9複合體史無前例地精準地切割DNA的CRISPR靶向序列文庫。

此外，這些研究人員開發出一種多重sgRNA（單嚮導RNA）表達策略，該策略促進單個基因功能性剔除和允許組合靶向。通過結合這些策略，他們設計和構建一種全基因組的序列驗證的陣列CRISPR文庫。

相關研究結果發表在2017年7月20日的Molecular Cell期刊上，論文標題為「A CRISPR Resource for Individual, Combinatorial, or Multiplexed Gene Knockout」。

轉載自生物谷

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